【摘要】 目的观察益气养阴方对小鼠肝癌血道转移的影响。方法小鼠经尾静脉接种h22肝癌细胞悬液后14 d，观察中药对荷瘤小鼠的肺部转移瘤生长情况影响等。结果益气养阴方组的肺部转移结节较模型组明显减少，中药组明显改善化疗对机体的免疫损伤。结论益气养阴方对h22肝癌血道转移有一定的抑制作用，并且增强机体的免疫功能。
【关键词】 益气养阴方 h22腹水型肝癌 血道转移
经血道转移是大多数恶性肿瘤转移的重要途径之一。临床上中医药在改善肿瘤患者生存质量，延长带瘤患者生存时间以及减少远处转移灶发生等方面具有独特的优势，已成为肿瘤的手术、放疗、化疗、生物疗法之外的另一重要治疗大法，探索中医药在防治肿瘤转移的作用受到越来越广泛的重视。益气养阴方在临床抗肿瘤转移治疗中多有应用，但动物实验对于益气养阴方的抗肿瘤转移研究目前尚无报道。为了进一步了解益气养阴方抗肿瘤转移的疗效及作用机理，本实验根据以往对益气养阴方的抗肿瘤转移的筛选工作结果，通过其对腹水型h22肝癌小鼠血道转移的抑制作用进行了观察研究。现报道如下。
1 材料
1.1 瘤株及动物小鼠腹水型h22肝癌瘤株，由山东省医学科学院药物所肿瘤室提供。昆明种小鼠30只，体质量(20±2)g，雌性，spf级，由山东中医药大学实验动物中心提供（动物合格证号：scxk鲁20030004）。Www.11665.cOM
1.2 药品益气养阴方中药由建联中药店提供，经山东中医药大学中药专家鉴定质量符合实验要求。注射用环磷酰胺（cytoxan，ctx），规格：200 mg/支，批号：031002，上海华联制药有限公司产品。
2 方法
2.1 转移模型的建立选取接种7 d的腹水瘤小鼠6只，各抽吸腹水1 ml，放入无菌容器中混匀。d-hanks液洗涤3次，台盼蓝染色，计数肿瘤细胞存活率＞95％。参考文献［1］调整细胞浓度为5×106 cell·ml-1，每只小鼠尾静脉注射细胞悬液0.2 ml。
2.2 分组与给药实验小鼠随机分为3组，每组各10只，分别为：模型对照组（简称造模组）、益气养阴方组（简称中药组）、环磷酰胺对照组（简称西药组）。造模组小鼠每天灌胃生理盐水0.1 ml/10 g；常规方法制备益气养阴方水煎液，浓缩至相当于原生药材4.3 g/ml药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。按人鼠等效剂量换算给药，中药组小鼠分别每天灌胃中药水煎液0.1 ml/10 g。西药组给予临床常用化疗药物环磷酰胺腹腔注射60 mg/kg，隔日1次。自造模之日起，连续给药14 d。脱颈椎处死小鼠，剥离肺脏，置于bouin固定液，常规石蜡切片he染色。
2.3 观察指标
2.3.1 体重变化称体质量，比较实验前后体质量变化情况。
2.3.2 免疫器官的影响取脾脏和胸腺称重，计算脾指数及胸腺指数。
2.3.3 肺转移瘤生长情况剥离肺脏称重，bouin液固定24 h观察，以单盲法计数肺转移瘤结节数，计算肺结节抑制率、肺转移瘤生长指数和肺转移瘤生长抑制率，光镜下观察瘤组织生长情况。
2.4 统计学方法计量资料用±s表示，用单因素方差分析(one-way anova)进行比较，等级资料比较用kruskal-wallis秩和检验，用spss14.0软件进行统计分析，以p＜0.05作为差异有显著性检验水准。
3 结果
3.1 体质量变化实验后造模组和中药组体质量有所增长，西药组体质量明显减轻；与造模组比西药组体质量减轻显著，p＜0.01；中药组与西药组比体质量增加有显著性差异（p＜0.01）。结果见表1。表1 益气养阴方对肝癌血道转移小鼠体质量影响的比较（略）
3.2 免疫器官的影响中药组脾重量、胸腺重量及指数较造模组明显升高，p＜0.05；西药组脾重量较造模组显著降低，p＜0.05；中药组脾和胸腺重量及脾指数较西药组明显增加（p＜0.01或p＜0.05）。结果见表2。表2 益气养阴方对肝癌血道转移小鼠免疫器官影响的比较（略）
3.3 肺转移瘤生长情况药物组的肺重量、肺瘤结节数和肺转移瘤生长指数较造模组均有下降，中药组肺瘤结节数与造模组比减少有显著性差异，p＜0.05；西药组肺重量和肺瘤结节数较造模组减少显著性差异，p＜0.05；中药组与西药组肺转移情况比无显著性差异（p＞0.05）。结果见表3。表3 益气养阴方对肝癌血道转移小鼠肺转移瘤生长影响的比较（略）
3.4 肺转移瘤的形态学观察肺转移瘤组织学检查类型为转移性h22肝癌瘤灶，肺转移瘤形态学表现为：造模组肺组织可见广泛的转移灶，结节大小不一，多分布于肺边缘、小血管周围或支气管周围，转移结节包绕各级气管，部分结节围绕血管生长呈“袖口状”，少数侵袭血管壁，甚至整个肺叶被瘤组织取代。中药组肺组织可见转移结节明显减少，以小转移灶为主，边界清楚，围绕血管生长或侵袭血管壁的现象较少，可见较多正常肺组织。西药组肺组织转移结节数量较造模组减少，大小不等，少数结节较大，多数结节边界清楚，也有围绕气管和血管生长并侵袭血管壁的现象。此结果与小鼠肺表面转移瘤结节数的结果相吻合。镜下观察肺转移程度结果显示：中药组与西药组肺转移程度均较造模组下降。造模组肺转移程度多为ⅲ级，没有ⅰ级的出现；中药组各级转移均有出现，但多集中为ⅱ级；西药组多以ⅱ级和ⅲ级转移为主（肺内转移瘤转移程度分级方法参考文献［2］）。统计学分析各组之间比较无显著性差异（p＞0.05） 。
4 讨论
中医学以其独特的辨证论治体系，在控制肿瘤转移方面的优势已为世人瞩目。其中，益气养阴法为常用治法之一，尤其在肺癌等肿瘤转移中疗效显著［3，4］。益气养阴方是已故著名中西医结合专家顾振东教授几十年临床经验总结。在治病求本、标本兼顾及扶正祛邪原则指导下，益气养阴的药物选择遵循了“益气不宜过于温燥，养阴不应过于滋腻”的原则，因温燥反耗气阴，滋腻易碍脾胃，在分清标本缓急、虚实主次的大前提下，对多种治法分层次、多方位有机组合，遣方用药做到主次分明、井然有序、药证相符，切中肿瘤晚期转移之气阴两虚，瘀毒内结的病机，达到遏制肿瘤转移的目的。经现代医学实验研究本方组成中各单味药多有抗肿瘤生长及转移的作用，并且临床抗肿瘤转移过程中亦多有选用。
目前对益气养阴方抑制肿瘤转移的研究领域存在一定的空白，我们以往已经对益气养阴方的抑制血管生长及抗肿瘤作用进行了一些试验研究工作［5］，在此基础上我们选择了h22肝癌血道转移模型进行深入研究，前期实验已经证实益气养阴方具有一定的抑制肿瘤自发转移及实验性淋巴道转移的作用（另有文章待发），本实验结果显示各给药组肺转移灶数目均明显少于造模组，具有统计学意义。通过转移抑制率及生长指数等指标计算和镜下转移程度的分级观察，显示本方对肿瘤转移的抑制作用明显优于西药组；但镜下转移程度的分级进行统计学分析各组之间比较无显著性差异，考虑样本数目较少所致。另外，研究证实肺重量与转移灶也有密切关系，肺转移瘤越多则肺重量越大，本研究的实验结果表明各给药组的小鼠肺重量均轻于造模组，有显著性差异，这从另一侧面也说明各给药组转移灶数量少于造模组或转移灶的体积小于造模组。肿瘤的发生、发展及预后又与患者的免疫状态密切相关。胸腺和脾脏重量在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱，脾指数反映体液免疫状况，胸腺指数反映细胞免疫状况。胸腺和脾脏对细胞毒剂高度敏感，在化疗药物作用下明显萎缩，其组织结构较快发生严重损伤，从而抑制机体免疫和抗病能力。本实验结果显示本方在抑制肿瘤细胞生长同时，对荷瘤机体的免疫系统具有一定的保护作用。荷瘤小鼠化疗后均出现免疫器官重量下降，而中药组能改善胸腺、脾脏的功能，提高胸腺、脾脏免疫器官的指数。由于胸腺和脾中以淋巴细胞为主，从这一意义上说，增重意味着两器官中淋巴细胞数量增加，同时以此为基础所派生的各种细胞因子数量也会增加，这与前述文献报道的益气养阴制剂临床及实验证实均有增强机体免疫功能的研究结论相符，说明本方抗肿瘤转移与提高机体免疫功能有关。
【参考文献】
［1］张云飞,罗文,陈健康,等.己烯雌酚对小鼠h22肝癌细胞肺转移的作用［j］.第四军医大学学报,2003，24(24):2244.
［2］高进,章静波.癌的侵袭与转移——基础与临床［m］.北京：科学出版社,2003：79.
［3］李邦华,曾纪权,袁国庆.益气养阴散结加化疗治疗ⅲ期非小细胞肺癌临床观察［j］.江西中医药,2001，32(1):21.
［4］刘嘉湘,施志明,李和根,等.益肺抗瘤饮治疗271例非小细胞肺癌临床观察［j］.上海中医药杂志,2001，2(2):4.
［5］孙静.益气养阴方对鸡胚绒毛尿囊膜（cam）血管生成的影响［j］.中华中医药学刊,2008，26(7): 1526
