【摘要】 目的 通过门静脉主干部分结扎附加3周后脾静脉缩窄及其属支结扎的方法建立犬的动物模型，观察门静脉系统变化，为该方法能否建立一种具有脾亢的门静脉高压症大动物模型提供依据。方法 实验犬25只，随机分为a组(正常组，n=5)、b组(对照组，n=10)、c组(实验组，n=10)。a组仅予以剖腹探查，b组予以门静脉主干部分结扎建立模型，c组则通过门静脉主干部分结扎附加3周后脾静脉缩窄及其属支结扎的方法建立模型，建模后术前及术后每周动态观察两组动物血象的变化，b、c组在预定时间点(术后第5、第9周)分别随机选择5只动物开腹观测门静脉自由压、脾脏大小、门体侧支循环形成情况，并切取脾脏行组织病理学检查，此外，术前及术后预定时间点了解骨髓增生情况变化。结果 两种方法建模后，门静脉自由压的增高明显，血常规示b组红细胞和血小板在术后3周明显低于正常值，4周后开始回升，而c组血红细胞和血小板的下降能够持续到术后第9周，且脾脏形态变化及术后脾脏组织病理学改变和骨髓增生情况证实c组较b组能够形成良好的脾功能亢进状态。结论 门静脉主干部分结扎附加3周后脾静脉缩窄及其属支结扎的方法建模后门静脉系统的变化符合门静脉高压症的表现，尤其是脾亢状态合适，具有良好的科研应用价值。
【关键词】 高血压，门静脉;脾功能亢进;模型，动物;犬
research on the establishment a model of prehepatic portal hypertension in dogschen yunzhi， deng liming， liao yi， et al. department of hepatolibiary surgery， the first affiliated hospital of wenzhou medical college， wenzhou 325000abstract objective to establish a new model with partial portal vein ligation at first and additional splenic vein stenosis and its collateral branches thoroughly ligated three weeks later， to observe change of the portal venous system in order to make sure whether it could establish a model of portal hypertension with hypersplenism or not. methods twenty-five dogs were divided into three groups： group a (normal group， n=5)， group b (control group， n=10) and group c (experimental group， n=10). partial portal vein ligation was proceeded in group b， in group c the model was establised by partial portal vein ligation at first and additional splenic vein stenosis combined with its collateral branches thoroughly ligated three weeks later， dogs in group a were just undergone lapboratory incision. portal vein pressure， size of spleen the collateral circulation of portal vein and the fluctuation of hematocyte counts were measured and recorded at the preconcerted time. histopathological changes of spleen and condition of bone marrow hyperplasia were examined. results two kinds of method of prehepatic portal hypertension developed in group b and c， the portal vein pressure increased significantly after nine weeks operating in both group b and group c. the rbc and plt counts in group c decreased obviously compared to group a and b after nine weeks operating. the splenic histopathology changes conformed to the changes of the congestive splenomegaly， and the hyperplasia of bone marrow was much more a obvious. conclusion this new method of establishing a model of portal hypertension is proved to be feasible， especially it can form satisfactory hypersplenism， so that it may be useful in the scientific research.
key words hypertension， portal; hypersplenism; models， animal; dogs
门静脉高压症的外科治疗经历了近百年的探索和研究，其手术方式经过不断的改进和创新，得以广泛应用于临床，然而门静脉高压症的外科治疗仍是当今外科界极为关注的难题。WWw.11665.CoM此外由于脾脏功能日益受到重视，保脾术式已经在脾外伤中得以应用，而门静脉高压症外科手术中是否予以切除脾脏成为目前争论的焦点之一，保脾手术和切脾手术对继发性脾亢的缓解以及患者术后血凝状态、免疫功能、生存质量等各方面影响的利弊关系尚无定论[1-3]。然而，国内外文献显示现有的门静脉高压症模型都未能有效地形成脾功能亢进，与人体实际的门静脉高压症表现的模拟度不够，因而在实验研究中迫切地需要一种能够形成脾亢的门静脉高压症的大动物模型，为此我们设想通过犬门静脉主干部分结扎附加3周后脾静脉缩窄及其属支结扎的方法来观察门静脉系统的变化以及脾脏形态功能的改变，试图制备一种具有脾功能亢进的门静脉高压症模型。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康成年雄性杂种犬25只，体质量10～15 kg，购于温州医学院动物实验中心。按照随机数字表法分为a组(正常组，n=5)、b组(对照组，n=10)、c组(实验组，n=10)。
1.2 模型制备方法 实验动物术前禁食12 h，禁水6 h，腹部备皮后以速眠新(长春市军需大学兽医研究所提供)肌肉注射(0.1 ml/kg)行全身麻醉，取剑突下正中切口约8 cm，逐层进腹，测量脾脏大小以及门静脉自由压，此后分离解剖暴露肝门部，游离门静脉主干约2～3 cm，测量其直径后，剪取一约1 cm长输液皮管，修剪到使其内径为门静脉直径的0.4倍，随后套住门静脉主干予以丝线部分结扎[4]， 完成门静脉主干缩窄达80%～85%，观察5 min肠道轻度淤血，无明显发黑，再次测量脾脏大小后逐层关腹。c组实验犬3周后再次进腹，测量门静脉自由压及脾脏大小，在脾静脉汇入门静脉处以相同的方法缩窄脾静脉主干约50%，观察脾脏侧支代偿情况，约10 min后彻底结扎脾门处的代偿侧支(保留脾胃韧带处的胃短血管)，完毕后逐层关腹，a组仅予以剖腹探查术。术前及术后3 d青霉素肌注(3～4万单位/kg，每天2次)，饮水不限，加强护理。实验动物按照预定时间点分别再次开腹，观察门静脉自由压、脾脏大小、门体侧支循环形成情况以及骨髓增生情况和脾脏组织病理学改变。b、c组在预定时间点(术后第5、第9周)分别随机选择5只动物开腹观测门静脉自由压、门体侧支循环形成情况及脾脏和骨髓检查等。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 外周血常规检测：术前及术后每周medonic ca620全血细胞计数仪监测外周静脉血红细胞数、白细胞数及血小板数(静脉取血后2 h内进行)。
1.3.2 门静脉自由压测定：实验动物术前及术后预定时间测定门静脉自由压(取胃网膜右静脉分支采用玻璃水柱法测定，以腋中线为零点)[5]。
1.3.3 脾脏大小测定：术前及术后预定时间测定脾脏轴径、横径及厚度，评估脾脏肿大程度。
1.3.4 脾脏的组织病理学检测：按预定时间点开腹切取动物脾脏，用10%的福尔马林固定，石蜡包埋，随后切片，脱蜡，he染色，封片，在光镜下观察病理改变。
1.3.5 术后开腹观察情况：术后预定时间开腹观察腹壁、食管胃底、腹膜后静脉曲张及侧支形成情况。
1.3.6 骨髓增生程度评分：套用人类的评定标准，检测各实验动物术前及术后预定时间的骨髓增生情况。极度活跃(有核细胞50%以上);明显活跃(有核细胞10%以上);活跃(有核细胞5%左右);减低(有核细胞1%以下);极度减低(有核细胞0.5%以下)。
1.4 统计学方法 采用方差分析。
2 结果
2.1 门静脉自由压的变化 b、c组实验犬门静脉自由压在术后即刻升高达术前近3倍左右，到第5周仍明显升高，此后压力有所下降但维持到术后第9周均高于术前，并且差异均有统计学意义(见表1)，而b组与c组之间比较差异无统计学意义。
2.2 血常规 b、c组外周血红细胞、血小板建模后开始下降，直到第3周后，b组两者开始回升，而c组能够持续下降到第9周[rbc(6.98±0.14)g/100 ml，术前为(7.41±0.25)g/100 ml;plt (427±29.6)×109/l，术前为(524±10.4)×109/l]，与术前比较差异均有统计学意义(p<0.01)。各组白细胞术后与术前比较无明显下降，术后前几周反而有所上升，总体变化没有统计学意义，见图1～3。
2.3 脾脏大小变化 如表2所示，c组脾脏长轴在建模后明显增大，并且能够持续到第9周，其差异均有统计学意义，而b组建模后脾脏长轴亦明显增大，但没有持续到术后第9周，见表2。
2.4 脾脏组织病理学变化 he染色：c组建模后5周动物脾窦扩张充血， 同时巨噬细胞对红细胞的吞噬现象多，可见到红细胞被破坏后，部分有形成含铁血黄素颗粒。术后9周的脾脏可见到淤血依然存在，但程度已减轻，此时脾窦及外套丛增生，巢状脾窦结构增加，还可见到明显的脾小梁增粗、脾窦上皮细胞排列紧密，并形成了腺样分支，脾脏呈纤维化改变。上述组织病理学表现符合慢性脾淤血改变。b组建模后5周脾脏亦呈慢性淤血性改变，但到第9周脾脏无明显纤维化改变。
2.5 骨髓细胞涂片检查 c组实验犬术后5周、9周骨穿检查显示骨髓细胞表现为增生明显活跃到极度活跃之间(按照人类的评分标准，正常犬骨髓细胞表现为增生活跃)，而b组实验犬第9周骨髓细胞增生程度明显不如c组。
2.6 门-体侧支循环情况 术后第4～6周开始实验动物腹壁可见到1条或数条的曲张静脉，在第5、9周我们观察到胃底食管，腹膜后静脉丛以及位于盆腔的痔静脉丛等门静脉系统与腔静脉系统的交通支都有不同程度的曲张，并且个别实验犬还出现肠壁肥厚，腹膜后水肿。
3 讨论
门静脉主干部分结扎法[6-7]是目前制备肝前型门静脉高压症模型的主要方法，具体操作如下：开腹游离门静脉主干后，并排放置一钝头注射针头，连同血管和针头予以结扎，随后抽出针头，完成缩窄。该方法适用于门静脉较细的动物，最常用的是大鼠。在该模型的基础上已经对门静脉高压症进行了大量血流动力学、病理生理学等方面的研究[8-10]，但不少作者提出现有的门静脉高压症动物模型对继发性脾功能亢进的制备并不理想[11]。随着近几年国内外对脾脏功能认识的逐渐深入，对门静脉高压症的治疗，很多单位都积极采取各种行之有效的保脾术式[12-14]。为了更好地了解功能亢进的脾脏在门静脉高压症手术中是否予以切除，以及哪种保留脾脏的手术方式更加符合门静脉高压症的治疗原则，制备一个理想的含有脾功能亢进的门静脉高压症动物模型就显得非常重要，而且该大动物模型由于其解剖结构清晰且与人有较好的同源性，也适合门静脉高压症外科治疗术式的改进和丰富，尤其是保脾术式的探讨和研究。
国内夏穂生、姜洪池教授等[15]认为脾亢应具备以下条件：脾脏肿大;外周血细胞计数有1种、2种或全部减少;骨髓增生活跃。而目前制备门静脉高压症模型的各种方法，之所以不能够形成脾功能亢进，其原因可能包括：其一是门静脉压力增高不足，脾脏不能够持续淤血肿大;其二则是门静脉压力足够，但是肿大的脾脏由于脾门处丰富的侧支形成而无法维持;另外，没有足够长的观察时间也是其重要因素之一。因此，我们根据泊肃叶方程(r=8 μl/πr4)，参照diéguez b等[4]的大鼠门静脉三重缩窄结扎的方法采取皮管套扎的方法获得尽可能高的门静脉压，以利于脾亢的形成。而在预实验中我们发现，门静脉部分结扎后迅速上升的门静脉压力使脾脏明显淤血肿大，术后3周内血细胞下降，但是此后脾脏淤血减轻，脾亢未能维持，我们考虑可能由于脾门处侧支循环的形成，系高压抵抗状态迅速缓解而致，于是我们结合程水兵等[16]通过脾静脉缩窄及其属支制备脾亢模型的方法，采取3周后附加脾静脉主干缩窄及其属支结扎的方法以加强脾脏淤血性肿大。
本实验各项观察指标的结果表明，改良的方法同单纯门静脉部分结扎法均能够形成门静脉系统的高压状态。两者术后即刻门静脉自由压升高达术前的近3倍，脾脏各径线也明显增大，血常规示前3周红细胞和血小板均显著下降，与术前比较差异有统计学意义(p<0.01)。不同之处在于：c组实验犬附加脾静脉缩窄及其属支结扎之后，脾脏的肿大及血细胞的下降能够维持到术后第9周，并且脾脏病理检查以及骨髓细胞增生情况证实，c组实验犬其脾亢状态能够基本维持到术后第9周，两组门体侧支循环的形成情况从术后5周和9周的观察来看并无明显差异，但是c组由于实验过程中人为地破坏了脾静脉的属支及脾门周围的侧支，因而该改良方法可能并不适合门静脉高压症门体侧支循环的研究。而wbc术后的改变可能同手术应激、切口线结反应以及术后的急性脾脏淤血刺激机体产生慢性炎症反应等有关。
门静脉高压症是指门静脉系统血运受阻、血流郁滞和压力增高的一种病理状态。临床上常表现有食管和胃底静脉曲张、脾脏肿大和脾功能亢进、腹水等症状[17]。本实验的研究表明，门静脉部分结扎附加3周后脾静脉缩窄及其属支彻底结扎的方法，其门静脉系统的变化基本符合门静脉高压症的表现。该方法同现有的各种制备门静脉高压症的方法相比，其优点在于能够形成良好的脾功能亢进。而且其操作简单、易于复制，尤其适用于门静脉高压症血流动力学改变对脾脏功能影响的相关基础研究，同时，也为门静脉高压症外科术式(尤其是保脾术式)的探索和开展提供实验依据。
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