作者：袁洁,何振健,吴珏珩,朱勋
【摘要】 目的探讨新型海洋源性蒽环类化合物d19的抗肿瘤作用及分子机制。方法 采用四甲基二氮唑蓝(mtt)比色法、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(tunel)、免疫印迹法(western blotting)检测d19对人乳腺癌细胞系mcf-7和mda-mb-435生长的影响及相关信号通路蛋白的变化。结果 d19对mcf-7、mda-mb-435的半数抑制浓度(ic50)分别为4.01 μmol/l和7.32 μmol/l;d19具有有效诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用;western blotting结果显示d19作用后细胞中的凋亡蛋白如caspase 9以及下游的效应蛋白parp都发生裂解。结论 从细胞水平和分子水平证明新型海洋源性蒽环类化合物d19具有很强的抗乳腺癌活性，有可能发展成为治疗乳腺癌等其他实体肿瘤的先导化合物。
【关键词】 海洋共生微生物;抗肿瘤;蒽环类化合物;人乳腺癌细胞;凋亡
abstract:objectiveto study the antineoplastic activity and mechanism of d19,a novel anthracycline derived from marine commensal microorganisms at both cellular level and molecular level. methods the inhibitory effects of d19 on growth of breast cancer cell lines were determined by mtt assay. the molecular signaling pathways of apoptosis were measured by terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)-mediated biotinylated deoxyuridine-triphosphate (dutp)-biotin nick end labeling (tunel) staining and western blotting. results ic50 of d19 on mcf-7 and mda-mb-435 cell lines were 4.01 μmol/l and 7.32 μmol/l respectively. tunel staining showed that d19 could induce apoptosis in mcf-7 cells. in addition,western blot detected some apoptosis proteins such as caspase 9 and parp being cleaved after treatment with d19. conclusion these results suggested that d19 might be used as a promising chemotherapeutical agent for patients with breast cancer and other solid cancer.
key words:marine commensal microorganism;antineoplastic;anthracycline;human breast cancer cells;apoptosis
长期以来，恶性肿瘤一直严重威胁着人类健康与生命。WWw.11665.Com据世界卫生组织统计，全世界每年约有600万人被癌症夺去生命，估计到2020年将升至1 000万人[1]。其中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，而且是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一。因此寻找有效的抗肿瘤化合物对于乳腺癌的治疗具有重要的意义。蒽环类化疗药物是目前临床应用广泛的抗肿瘤一线化疗药物，尤其是乳腺癌化疗中最常用的药物，但是此类药物仍存在骨髓抑制性、心脏毒性问题，以及肿瘤患者长期使用出现的多耐药现象，大大限制了其剂量提高和临床治疗效果[2-4]。因此，有必要寻找更好的同类化疗替代药物[5]。本文从分子水平和细胞水平对海洋微生物来源的蒽环类化合物d19抗人乳腺癌作用进行了研究，为该化合物最终成为抗肿瘤药物提供理论依据，并为进一步开发高效低毒的抗肿瘤新型候选药物奠定基础。
1材料与药物
人乳腺癌细胞系mda-mb-435、mcf-7为本实验室保存，并已在本实验室已发表的其他研究项目中使用[6]。d19由中山大学化学与化学工程学院林永成教授提供[7]。各种化合物由二甲基亚砜(dmso)(sigma公司)制备保存母液。
2方法
2.1细胞培养
人乳腺癌细胞系mcf-7、mda-mb-435培养于含5%(φ)胎牛血清(hyclone公司)、2 mmol/l l-谷氨酰胺、 0.1 mmol/l非必需氨基酸、 10 mmol/l hepes(缓冲液)、100 iu/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的dmem完全培养基中(以上细胞培养相关试剂均为invitrogen/gibco公司产品，购自invitrogen公司)，置于37 ℃ 5%(φ) co2孵箱中孵育培养。传代时用含0.02%edta的0.05%(φ)胰酶消化，以dmem完全培养基终止消化。
2.2四甲基偶氮唑蓝(mtt)比色实验
将mcf-7和mda-mb-435细胞消化后计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96 孔细胞培养板中，置于37 ℃ 5%co2孵箱中孵育培养。24 h后更换为含浓度依次为0、0.001、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/l d19的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入质量浓度为5 mg/ml mtt(genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/ml，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存)溶液20 μl，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入dmso 150 μl，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为490 nm下的吸光度a值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均a值-实验组平均a值)/对照组平均a值×100 %。对照组即d19浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度(ic50)计算软件bliss’s software 计算ic50，应用spss软件行数据统计分析。
2.3脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(tunel)染色
将mcf-7细胞消化后计数，按每孔1.0×105个细胞分别接种至已铺有盖玻片的24孔细胞培养板中，24 h后用0.1 μmol/l d19处理细胞。将50 μl terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)反应缓冲液加至细胞上，将培养板置于湿盒中于37 ℃避光反应60 min。吸弃反应液，加入2×ssc室温作用15 min，用pbs洗涤3次，每次5 min。加入1 μg/ml pi 避光作用15 min，再用pbs洗涤3次，每次5 min。最后将盖玻片上的细胞避光干燥过夜，次日加anti-fade封片。在荧光显微镜下进行观察并拍照保存图片，tunel染色阳性荧光信号呈绿色，pi荧光信号呈红色。tunel细胞凋亡检测试剂盒为promega公司产品。
2.4western blotting检测相关蛋白
收集得到不同浓度梯度处理的细胞裂解液，按bca法进行蛋白定量(美国pierce公司)。电泳后，转膜到pvdf膜上，固定后常温孵育3 h或4 ℃过夜，鼠抗人caspase-9(美国bd biosciences公司);兔抗人parp(美国cell signaling technology公司);α-tubulin(美国sigma公司)，再孵育相应二抗(美国pierce公司)，最后在暗房用ecl显色液(美国pierce公司)显色发光。
3结果
3.1d19对乳腺癌细胞的抑制作用
d19 对人乳腺癌细胞mcf-7和 mda-mb-435的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性，对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞mda-mb-435抑制率最高，对低致瘤性、对低转移的人乳腺癌mcf-7抑制率其次(见图1)。其作用48 h的半数生长抑制浓度(ic50)分别为4.01 μmol/l和7.32 μmol/l。[psa6691;s*2〗图1d19对人乳腺癌细mcf-7和mda-mb-435作用48 h 的剂量-抑制效果figure 1the dose-dependant proliferation inhibition effect of d19 in human breast cancer cell lines,mcf-7 and mda-mb-435 were treated with the indicated concentrations for 48 hd19处理48 h后，mcf-7、mda-mb-435细胞密度较对照组明显降低，随着药物浓度的增加，细胞密度进一步显著降低。在光学显微镜下放大200倍可观察细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化，贴壁细胞开始出现体积变小、变形、皱缩、变圆、脱落(见图 2、 3)。[psa6692;s*2〗图2人乳腺癌 mcf-7细胞经不同浓度的 d19作用 48 h 后的形态学变化(200×)figure 2morphological changes of mcf-7 human breastcancer cells treated with indicated concentrations of d19 after 48 h (200×)
3.2d19抗肿瘤活性的机制
3.2.1tunel检测d19 诱导乳腺癌细胞凋亡的结果人乳腺癌细胞 mcf-7经 16 μmol/l 的d19 作用 24 h后，出现大量 tunel 染色阳性的细胞，而对照组未经d19 作用的细胞基本未见 tunel 阳性出现(见图4)。在荧光显微镜下任意选取10个视野对tunel阳性细胞进行计数，统计得到d19作用组的tunel阳性细胞数比对照组高达70倍(见图5)。结果表明，d19的作用能够有效诱导人乳腺癌细胞mcf-7凋亡。d19对mda-mb-435细胞处理的结果相类似。[psa6693;s*3〗图3人乳腺癌 mda-mb-435细胞经不同浓度的 d19作用 48 h 后的形态学变化(200×)figure 3morphological changes of mda-mb-435 human breast cancer cells treated with indicated concentrations of d19 after 48 h (200×)[psa6694;s*2〗图4tunel检测d19诱导乳腺癌细胞mcf-7凋亡的结果 (100×,c/16 μmol·l-1,24 h) figure 4tunel detected the effect of d19 induces apoptosis in mcf-7 (100×,c/16 μmol·l-1,24 h)[psa6695;s*2〗与对照组比较：**p<0.01图5d19作用于乳腺癌细胞mcf-7的tunel阳性细胞定量 (24 h)figure 5tunel positive cells quantification after treated by d19 on mcf-7
3.2.2d19作用后乳腺癌细胞中凋亡蛋白表达水平的变化
为进一步明确d19导致人乳腺癌细胞mcf-7凋亡的分子机制，本文以时间梯度收mcf-7的总蛋白做western blotting。随着处理时间逐渐增加，caspase-9和parp的前体逐渐减少，切割体逐渐增加(见图6)。α-tubulin作为内参。结果显示，d19作用后的mcf-7细胞通过激活caspase诱导细胞凋亡。[psa6696;s*2〗图6d19作用后人乳腺癌细胞mcf-7中caspase 9和parp的表达水平变化figure 6time-dependent effect of d19 on caspase 9 and parp in mcf-7
4讨论
肿瘤的化疗、放疗及生物学疗法是治疗肿瘤的重要手段，这些手段的主要机制在于利用化学药物、放射线或免疫制剂诱导肿瘤细胞发生凋亡。近年来研究一些抗肿瘤药物的作用机制时，除了研究其对dna等大分子化合物合成及其结构的影响外[8]，还研究其对细胞凋亡的影响，发现抗代谢药物中的甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、topo-i酶抑制剂喜树碱、topo-ii酶抑制剂鬼臼乙叉甙、阿霉素，以及顺铂、三尖杉酯碱、紫外线及γ-射线等，均可诱导细胞凋亡。因此认为细胞凋亡对肿瘤发生发展起着重要作用。如果对凋亡与抗肿瘤药物之间的关系进行深入研究，有可能改善目前肿瘤临床药物治疗的效果。
海洋作为一种特殊的生长环境(高盐、高压、缺氧、缺少阳光等)，使海洋生物能够产生并积累大量化学结构、生理活性与功能均十分特殊的物质，为此提供了一个丰富的新颖结构的化合物库 [9-12]。蒽环类化合物以阿霉素、表阿霉素为代表，具有抗肿瘤的生物活性[13-14]。本研究结果表明，从南海海洋共生微生物的次生代谢产物中筛选到的d19，具有蒽环类化合物的基本骨架。在体外实验中对人乳腺癌细胞表现出明显的抗肿瘤活性。值得注意的是，其对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞 mda-mb-435 抑制率最高(ic50= 4.01 μmol/l)，对低致瘤率、低转移的人乳腺癌 mcf-7 抑制率稍低(ic50=7.32 μmol/l)。提示d19抑制肿瘤细胞生长的分子机制中可能存在对恶性肿瘤特异性的靶点。
目前认为，诱导细胞凋亡主要有caspase依赖途径和非caspase依赖途径，而以caspase依赖途径为主，caspase激活有外源性和内源性两条途径[15-18]。为了探讨d19的抗肿瘤作用分子机制，用 tunel 染色法分析了d19引起的细胞变化，发现该化合物能有效诱导人乳腺癌mcf-7细胞凋亡。同时western blotting结果显示d19作用后，乳腺癌细胞中的凋亡蛋白如caspase 9及下游的效应蛋白parp都发生裂解，说明d19能够诱导细胞通过caspase依赖的细胞凋亡而发挥抗肿瘤的活性。这一结果为深入研究d19 抗肿瘤活性的分子机制提供了线索。
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