作者：李华， 汪根树， 张剑， 姜楠， 贾昌昌， 杨扬， 陈规划
【摘要】 【目的】 制备出一种人硫氧还蛋白(htrx)基因修饰的肝细胞。 【方法】 逆转录聚合酶链反应法扩增出htrx cdna，应用重组逆转录病毒制备htrx基因修饰大鼠肝细胞。白蛋白免疫组化sabc法进行肝细胞活性鉴定，mtt比色试验进行抗氧化应激能力检测。【结果】 克隆出htrx开放阅读框cdna并制备出重组逆转录病毒，感染真核细胞后可分泌融合表达的htrx并具有生物学活性。制备出htrx基因修饰大鼠肝细胞，免疫组化sabc法显示肝细胞功能正常，mtt比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(p < 0.05)，并可有效增殖。【结论】 成功制备出一种具有较强抗氧化应激的htrx基因修饰肝细胞。
【关键词】 肝细胞; 人硫氧还蛋白; 基因修饰
abstract： 【objective】 to prepare the human thioredoxin (htrx) gene-modified hepatocytes. 【methods】 htrx cdna was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (rt-pcr)， recombinant retrovirus was applied to primary cultured rat hepatocyte for infection to generate htrx gene-modified rat hepatocytes， whose viability and antioxidative capacity were examined with albumin-immunohistochemical staining and mtt assay， respectively. 【results】 the htrx open reading frames cdna was cloned and assembled with recombinant retrovirus， then eukaryotic cells infected by this virus were capable of expressing bioactive htrx in the form of fusion proteins. immunohistochemistry demonstrated normal function of the htrx gene-modified hepatocytes， which possessed strong antioxidative capacity as shown by mtt assay and could be proliferated effectively. 【conclusion】 the htrx gene-modified hepatocyte with more stronger antioxidative capacity is prepared.
人硫氧还蛋白(human thioredoxin， htrx)是目前已知trx中活性最好的蛋白，由trx构成的氧化还原系统广泛存在于组织细胞中，具有清除自由基和维持体内稳定的氧化还原状态的重要作用，对缺血再灌注损伤有明确的保护作用。www.11665.CoMtrx也可通过对转录因子如nf-κb等的调节作用，促进细胞的增殖及抑制细胞的凋亡等[1-2]。研究发现trx对肝细胞生存生长具有明显的促进作用[3]，同时其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。但能否持久地促进肝细胞的增殖，减少凋亡和氧化应激成为trx应用的关键。本实验成功进行了htrx基因修饰肝细胞的制备，修饰后的肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细胞损伤等。
1 材料和方法
1.1 htrx cdna基因克隆
根据genbank中htrx cdna 序列(j04026)设计引物，引入bglⅱ、bamhⅰ酶切位点，并加入对框序列tt(不含终止子taa)。引物：正向5′- gcagatctatggtgaagcagatcgagag-3′，反向5′-gcggatccttgactaattcattaatggtggctt c-3′。异硫氰酸胍一步法从143(tk-)人骨肉瘤细胞中提取模板rna。应用锚定引物oligo(dt) 15逆转录合成cdna第一条链，聚合酶链反应(pcr)扩增htrx cdna基因，插入载体质粒pgem-t easy构建重组质粒pgem/htrx，并进行基因序列测定。质粒的制备、纯化、酶切、连接及转化按常规方法进行。
1.2 含htrx基因的重组逆转录病毒载体的构建
大量制备逆转录病毒载体plegfp-n1(购自clontech公司)，将其和pgem/htrx分别行bglⅱ、bamhⅰ联合酶切、回收、连接。筛选鉴定含htrx基因的重组质粒plegfp/htrx。
1.3 重组逆转录病毒的制备
运用磷酸钙共沉淀转染法进行重组逆转录病毒的制备。取plegfp/htrx，电泳定量约1 g/l。加入2.5 mol/l cacl2，加至复苏的pa317细胞(胚胎成纤维细胞)表面，可见细密沉淀钙粒形成。37 ℃下co2培养箱内培养8 h，加入含100 ml/l小牛血清的dmem培养液，置37 ℃培养箱内72 h。2.5 g/l胰酶消化后按1：3传代，质量浓度为400 μg/ml的g418(一种氨基糖苷类抗生素)筛选高表达细胞株。14 d时有多个抗性克隆形成，细胞克隆单瓶培养至抗性细胞形成单层，消化传代后，加入dmem培养液(不含g418)培养;收集细胞上清液进行病毒浓缩纯化。加入预冷饱和硫酸铵， 透析纯化浓缩，经0.22 μm微孔滤膜除菌处理。
1.4 重组逆转录病毒滴度测定
复苏nih3t3细胞(小鼠胚胎成纤维样细胞)，铺满培养瓶后，2.5 g/l胰酶消化，培养接种于24孔培养板。将制备的多组病毒液均相应作104、105和106倍稀释接种在细胞表面;37 ℃，5%体积分数co2条件下培养72 h，荧光显微镜下观察每孔含荧光的细胞数，计算病毒滴度，选择最高滴度的病毒液为实验用重组病毒。重组质粒含egfp，与目的基因表达的蛋白融合，荧光显微镜下显现绿色荧光，较好地反映重组逆转录病毒的形成情况及感染活性。
1.5 重组逆转录病毒感染细胞后htrx表达和活性测定
用胰岛素还原实验进行重组逆转录病毒感染细胞后htrx表达和活性测定。取重组逆转录病毒液，接种于nih3t3细胞表面。37 ℃，5%体积分数co2条件培养后取上清液，取不同体积(25 μl、50 μl、100 μl)上述标本，加入实验用buffer，30 ℃反应，检测波长为650 nm时的吸光度。另取空质粒plegfp-n1、dmem培养基制备对照组，本实验前期制备的htrx作为标准品阳性对照(1 μmol/l，2.5 μmol/l，10 μmol/l)[2]。比较各组酶反应速度(某一浓度的酶在达到最大吸光度值时与所用最小时间之间的比值，用以反映该酶反应的活性)。
1.6 htrx基因修饰大鼠肝细胞的制备
原代sd大鼠肝细胞的培养方法同前所述[2]。将分离的大鼠肝细胞按1 × 106细胞/ml接种于涂有多聚赖氨酸培养瓶中，加入含100 ml/l小牛血清dmem培养基培养，加入重组逆转录病毒原液及8 μg/ml polybrene(凝聚胺)作用3 h;重复感染一次，继续培养48 h，至培养肝细胞80%成片，以400 μg/ml g418筛选肝细胞抗性克隆并生长稳定成片，荧光显微镜下观察肝细胞中荧光蛋白表达情况。空质粒plegfp-n1制备的逆转录病毒制备对照组肝细胞。
1.7 htrx基因修饰大鼠肝细胞活性鉴定
白蛋白免疫组化sabc法进行肝细胞活性鉴定。将制备的病毒感染肝细胞以2.5 g/l胰酶消化后接种于盖玻片上，37 ℃，5%体积分数co2培养4 h使细胞贴壁紧密，丙酮固定。一抗兔抗鼠白蛋白单克隆抗体(1 ∶ 200)，二抗生物素化hrp-山羊抗兔单克隆抗体igg(1 ∶ 4000)。dab显色，以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色。正常大鼠原代培养肝细胞作为阳性对照。
1.8 htrx基因修饰大鼠肝细胞抗氧化应激能力检测
mtt比色试验进行抗氧化应激能力检测。将肝细胞(htrx基因修饰大鼠肝细胞、空质粒plegfp-n1转染病毒感染肝细胞及正常大鼠肝细胞)制成单细胞悬液，以每孔100 μl，细胞数104接种于96孔培养板上，培养至细胞80%成片，加入实验浓度为200 μmol/l h2o2作用12 h、24 h和48 h，每孔加入新鲜配制的mtt(5.0 g·l-1) 25 μl作用4 h，待出现蓝色结晶后，加入二甲基亚砜(dmso) 150 μl，震荡使其溶解， 570 nm波长下测定各组不同时间吸光度值，绘制生长曲线。
1.9 统计学方法
采用spss 13.0统计软件包处理，组间均数比较采用单因素方差分析，率的比较为?字2检验。
2 结 果
2.1 克隆基因的序列
克隆上的htrx开放阅读框cdna基因序列为315 bp(含起始子atg、不含终止子taa)，推导氨基酸数104个(不含起始子atg编码的met)。另外可见bglⅱ、bamhⅰ识别位点及对框碱基tt。与已知序列比对2个碱基发生改变：第117位c→g、第221位c→t，这可能由于模板来源不同所致，其它碱基完全一致。推导的氨基酸序列，第39位asn→lys，第74位thr→met，存在活性位点保守序列—trp—cys32—gly—pro—cys35—lys—，以及其外侧3个半胱氨酸cys残基cys62，cys69和cys73。
2.2 plegfp/htrx的筛选
重组质粒经bamhⅰ单酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳见7 172 bp处有一光亮带;bglⅱ、bamhⅰ双酶切后在323 bp、6 849 bp 处各有一光亮带，与理论值完全一致，确定为plegfp/htrx重组载体质粒(图1)。
2.3 重组逆转录病毒滴度
本实验最高病毒滴度为2.80 × 106感染数/ml，选择该组进行扩增生产重组逆转录病毒，进行后续实验。
2.4 重组逆转录病毒感染细胞后htrx表达和活性
重组病毒组、空质粒病毒组及无病毒组之间酶反应活性的比较见表1，可见在各个反应剂量重组病毒组酶反应速度均远高于空质粒病毒组和无病毒组 (p = 0.02)，显示有较高的酶反应活性，并有一定的剂量依赖性。该结果与标准品组实验结果相似。提示本实验制备的重组病毒感染真核细胞后，细胞可分泌融合表达的htrx并具有硫氧还蛋白生物学活性。
2.5 htrx基因修饰大鼠肝细胞的制备和活性
实验制备的htrx基因修饰大鼠肝细胞有egfp绿色荧光蛋白表达。免疫组化sabc法检测可见细胞浆内出现棕黄色颗粒的阳性染色，表明htrx基因修饰大鼠肝细胞可分泌表达白蛋白，细胞功能正常(图2)。
2.6 htrx基因修饰大鼠肝细胞抗氧化应激能力
htrx作为一种抗氧化剂，具有较强的抗氧化应激能力。打击实验中，mtt比色法检测在12 h和24 h时，htrx基因修饰组与空病毒组、正常肝细胞组d(650 nm)值比较有统计学意义(p = 0.02)，48 h时差异有明显统计学差异(p = 0.003)，而后两组在任何时间段差异均无统计学意义(p = 0.31，表1)。显示出htrx基因修饰大鼠肝细胞具有较强的抗氧化应激能力，并可有效增殖，表明htrx具有明确的肝细胞保护作用。各组生长曲线之间的比较见图3。
3 讨 论
肝细胞移植技术已具有较为完备的实验及理论基础，可以治疗多种肝相关疾病，但尚有许多问题有待进一步解决，包括增殖、免疫、养营等。成熟肝细胞为终末分化细胞，分裂增殖能力较差，也不能冷冻保存，移植后增殖缓慢及增殖能力受限。由于移植肝细胞数量的限制以及很难得到满意的增殖，肝功能支持的时间及受损肝实质的替代的程度不甚理想，有研究显示其替代作用一般不超过受体肝脏功能的1%，提高移植肝细胞的增殖指数、防止过多凋亡及氧化应激成为需要重点解决的关键问题之一[4]。促进干细胞向成熟肝细胞定向转化的研究尚需完善[4]，对成熟肝细胞的改造仍有现实的意义。
htrx在细胞生存和生长中具有极重要的作用，它的生物学功能包括促进细胞dna和蛋白质合成、生长因子样作用、抗氧化作用、转录因子调节以及凋亡抑制作用等。我们前期制备出具有生物学活性的rhtrx对原代培养肝细胞的生存生长也显示出具有促进作用[3]。外源性htrx在体内实验中局部应用较难进入细胞内部，很快代谢使其作用不够持久[6]。本实验将目的基因导入离体肝细胞，从而达到在体内长期表达的目的。
目前已有多个实验对肝细胞进行体外基因修饰，主要在于增强移植肝细胞的增殖与功能，降低移植后的排斥反应和逆转肝纤维化等。在提高增殖方面，有研究将外源性基因片段整合入肝细胞dna中，成为所谓“永生化细胞”，并能够加以人为控制[7-8];敲除与抑制细胞增殖密切相关基因的小鼠肝细胞，移植后细胞增殖数量明显增加[9];将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， vegf)、bcl-2、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor， hgf) 等基因导入供体肝细胞后移植，肝细胞的存活和再生增加，抗凋亡能力明显增强[10-13]。本实验制备出htrx基因修饰肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细胞损伤并可有效增殖，也进一步表明htrx具有明确的肝细胞保护和促进增值作用。这种htrx基因修饰肝细胞可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。
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