摘要】  　　目的: 从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法: 采用离子交换和亲和层析技术进行纯化。结果: 从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶, 不需活化即可水解激肽原, 释放激肽, 并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯, 比活可达800 u/mg以上, 远远高于哺乳动物来源的激肽原酶, 纯度可达95%以上。对其性质考察, mr为38 000, n-末端的15个氨基酸序列分析表明, 该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽释放酶同源。结论: 这种方法适合于工业化生产。

【关键词】  江浙蝮蛇 蛇毒 激肽原酶

　　自从有人在美洲矛头蝮蛇(bothrops jararaca)蛇毒中发现激肽原酶后, 蛇毒激肽原酶越来越受到广大学者的重视［1］。我国蛇类资源丰富, 但受提纯工艺的限制, 至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们采用离子交换和亲和层析技术, 从江浙蝮蛇（agkistrodon halys pallas）蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶, 并对其性质进行了研究。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  江浙蝮蛇蛇毒冻干粉（辽宁省清源县）,  deae-sepharose , 琼脂糖凝胶（瑞典pharmacia公司）,  苯甲酰精氨酸乙酯（baee）,  对甲苯磺酰精氨酸甲酯（tame）,  标准蛋白,  激肽原,  激肽等底物（sigma公司）,  低压型高效液相色谱仪（日本岛津公司）,  8823b紫外检测仪（北京宾达英创科技有限公司）,  balb/c小鼠（7周龄）由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。Www.11665.Com

　　1.2  方法

　　1.2.1  蛇毒激肽原酶的分离纯化   （1）deae-sepharose离子交换色谱: 称取江浙蝮蛇毒15 g,  用0.02 mol/l  ph7.8的tris-hcl缓冲液溶解, 以4 000 r/min离心20 min, 取上清, 透析12 h后, 以6.0 ml/min的流速上阴离子交换柱（deae-sepharose）, 上样完毕后以0.02    mol/l ph7.8的tris-hcl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。（2）亲和色谱法:    ①免疫抗体亲和层析柱的制备: 取少量离子交换色谱活性洗脱液, 用高效液相色谱法纯化并经定性得到蛇毒激肽原酶, 取该蛇毒激肽原酶50 μg与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物, 对7周龄的balb/c小鼠皮下注射免疫, 每次0.2 ml, 每周1次, 共免疫6次。在采集血清前3 d取0.2 ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4b-sepharose琼脂糖凝胶, 把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上, 从而制成免疫亲和层析柱。 ②亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶: 将经离子交换纯化的酶用平衡液透析, 上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液（0.02 mol/l  tris-hcl缓冲液,  ph7.2,  含0.5  mol/l nacl,  70  g/l arg）洗脱。收集洗脱峰, 冷冻干燥保存。（3）纯度检测: 取主峰组分适当稀释, 用高效液相色谱（hplc）法检测。色谱条件: tsk-2000sw凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 进样量20 μl。

　　1.2.2  比活性测定  ① 舒缓激肽原酶活力测定［2］: 取0.2 ml激肽原底物（20  g/l, 0.05 mol/l,  ph7.8磷酸缓冲液配制）,  加0.1 ml酶液, 37℃水浴保温3 min, 立即取0.15 ml测离体豚鼠回肠平滑肌收缩幅度, 用0.1 μg激肽做对照, 以每毫升酶液3 min释放相当于1 μg激肽定为1活力单位（u）。②精氨酸酯酶活力的测定: 以baee及tame为底物测定［3］。③蛋白含量的测定: 采取凯氏定氮法测定蛋白质含量。

　　1.2.3  理化性质  ①电泳法相对分子质量（mr）测定: 以兔磷酸化酶b（mr 97 400）、 牛血清白蛋白（mr 66 200）、 兔肌动蛋白（mr 43 000）、 牛碳酸酐酶（mr 31 000）、 胰蛋白酶抑制剂（mr 20 100）、 鸡蛋清溶菌酶（mr 14 400）作标准蛋白, 用还原型sds聚丙烯酰胺电泳法测定。②高效液相色谱分析: 色谱条件（tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min,  0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相）。以牛血清白蛋白第v组份（66 200）、 卵清蛋白（44 300）、 木瓜蛋白酶（mr 21 000）、 溶菌酶（mr 14 300）为标准蛋白, 测定纯度及mr。③n-末端氨基酸残基测定: pvdf膜上样, abi　procise 491型测序仪测定。

　　1.2.4  酶学性质  ①最适ph: 将baee配于不同ph的0.05  mol/l  tris缓冲液中, 测定激肽原酶水解baee的最适ph。②不同ph值下的稳定性: 将激肽原酶分别溶于不同ph值的0.1 mol/l tris缓冲液, 于室温静置24 h后, 取样测定水解baee底物的活性。③不同温度下的稳定性: 将激肽原酶分别于不同温度下保温3 h, 测定水解baee的活性。④edta对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含0.1 mol/l edta的溶液, 测定水解baee活性。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含ca2+、  zn2+ 、 co2+、 hg2+、 mg2+、 ba2+0.01~0.1 mol/l的溶液, 测定其水解baee的活性, 并用edta络合后再分别测定其水解baee活性。

　　2  结果

　　2.1  蛇毒激肽原酶的分离纯化  蝮蛇毒经deae-sepharose阴离子交换层析, 亲和层析, 可将杂质蛋白除去, 得到的样品经hplc检验, 纯度可达95%以上。

　　图1  deae-sepharose离子交换色谱图（略）

　　透过峰过后, 梯度洗脱得到5个峰, 经定性检测3, 4号峰为活性峰.

　　图2  蛇毒激肽原酶亲和色谱图（略）

　　1: 平衡液洗脱透过峰; 2: 为亲和洗脱液洗脱所得活性峰.

　　图3  激肽原酶纯度检验图谱（略）

　　色谱条件: tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速 1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 对峰面积积分, 主峰面积达95%以上.

　　图4  激肽原酶sds聚丙烯酰胺电泳图谱（略）

　　m: 分子量标准品; s: 蛇毒激肽原酶样品.

　　2.2  活性测定  与粗毒相比, 提纯高的激肽原酶比活提高了约300倍, 活力回收率可达60%以上, 水解baee的比活可达到800 ｕ/mg以上, 水解tame活性较低, 约是水解baee活性的5%。

　　2.3  理化性质  经sds聚丙烯酰胺电泳及hplc方法检测, 江浙蝮蛇毒激肽原酶的mr约为38 000, 与组织型激肽原酶相似。

　　2.4  江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列［4］比较  蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶具有同源性,  属丝氨酸蛋白酶的一种,  且与哺乳动物的胰蛋白酶——激肽释放酶具有同源性。

　　表1  江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列比较（略）

　　2.5  酶学性质  ①最适ph: 测定蛇毒激肽原酶水解baee底物活性的最适ph值为7.0~8.0,  这与哺乳动物的组织激肽原酶相同, ph10以上, 底物自发水解无法测定。②不同ph值下的稳定性: 蛇毒激肽原酶在ph4.0~9.0条件下,  活性基本不变, ph低于4.0或高于9.0时, 活性迅速下降, ph大于10.0时, 底物baee发生水解而无法测定。③不同温度下的稳定性: 在30℃以下时, 激肽原酶的活力基本不变, 超过40℃时, 活力迅速下降, 高于60℃时, 发生蛋白质变性而有沉淀析出。④edta对激肽原酶活性的影响: edta对激肽原酶的活力无影响, 证明蛇毒激肽原酶不是金属酶。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: ca2+、 mg2+、 ba2+对激肽原酶活力无影响, zn2+（0.1 mol/l）、 hg2+（0.01 mol/l）、 co2+（0.1 mol/l）可完全抑制激肽原酶活性, 且用edta络合不能使其活力恢复, 蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 故hg2+可使其活性丧失, 但zn2+ 、 co2+对其活性影响的原因尚不明确, 可能是因为与蛇毒激肽原酶不可逆性结合, 从而改变其构象使其失活。

　　3  讨论
    　　
　　激肽原酶在体内有重要的生理功能［5］, 目前临床广泛用于原性高血压、 心绞痛、 动脉硬化、 视网膜血流障碍、 肢端知觉异常, 闭塞性血栓性血管炎等疾病的治疗。但因为以往从哺乳动物的胰腺提取的胰激肽原酶纯度不高, 具有一定的抗原性, 进入人体后, 可能诱发过敏抗原抗体反应, 已有报导注射胰激肽原酶导致固定性药疹［6］及重症多形红斑药疹［7］, 且不能实现静脉给药, 使药物不能最大限度发挥效用。近年的提取工艺虽可得到高纯度激肽原酶, 但在提取过程中, 酶活力损失较大, 回收率低, 难以实现工业化生产, 因此寻找高纯度且无抗原性的激肽原酶并建立一套适合工业规模化生产的工艺方法是目前面临的新课题。
   
　　我们在传统提取工艺的基础上, 用离子交换, 亲和层析两步即可制备高纯度的蛇毒激肽原酶, 该方法设备简单, 条件温和, 产品回收率高, 产量大, 完全符合工业化生产的要求, 填补了蛇毒激肽原酶生产工艺上的一项空白。与哺乳动物来源的激肽原酶相比, 从江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特点: ①比活高（≥800 u/mg）,  mr小（约为38 000）, 等活力单位给药蛋白含量低, 不易引起过敏反应; ②纯度高, 提纯后纯度可达95%以上。如果用于药物, 大大提高了药物的安全性; ③无病毒隐患。不携带可能同人类共同感染的病毒。④无酶原形式, 不需活化即可释放激肽, 可直接发挥作用。该蛇毒激肽原酶最适ph值为7.0~8.0, 且在ph4.0~9.0范围内, 活力基本保持不变, 有利于在人血浆环境中保持其活性。该酶在30℃以下活力基本不变, 而在冻干状态下, 37℃放置90 d, 活力下降在5%以内, 经试验, 在整个冻干制剂生产过程中, 酶活力的损失率均在10%以内, 因此可以生产出相对稳定的制剂产品。n-末端的氨基酸测序结果表明, 蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶同源, 属丝氨酸蛋白酶的一种, 可能也具备大多数蛇毒丝氨酸蛋白酶的特性具有较长的生理半衰期, 可能成为临床用药; 同时, 它与哺乳动物的胰蛋白酶激肽释放酶具有同源性, 可以部分解释其与组织激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 不是金属酶, 而zn2+、 co2+对酶活性的影响的机制可能与改变其构象有关, 有待进一步证明。
   
　　总之, 我们从蛇毒提取的激肽原酶将为药学领域提供一条新的途径, 应用于药物必将带来临床新的治疗方法。

【参考文献】
  　　［1］ yousef gm, diamandis ep. an overview of the kallikrein gene families in humans and other species:emerging candidate tumour markers［j］. clin biochem, 2003, 36(6): 443-452.

　　［2］ 王心民, 戚正武. 浙江蝮蛇（agkistrodon halys pallas）蛇毒激肽释放酶i的分离纯化及其性质的研究［j］. 生物化学与生物物理学报, 1984, 16（1）: 15-25.

　　［3］ 韦传宝, 陈建智. 蛇毒蛋白组分的鉴定［j］. 中国毒蛇学, 1995: 370.

　　［4］ wang ym, wang sr, tsai ih. serine protease isoforms of deinagkistrodon acutus venom:cloning,sequencing and phylogenetic analysis［j］. biochem j, 2001, (354): 161-168.

　　［5］ 华 慧, 周思翔, 王正荣. 组织激肽释放酶家族、 激肽释放酶—激肽原—激肽系统及其重要应用［j］. 国外医学·生物医学工程分册, 2004, 27（5）: 301-305.

　　［6］ 胡明侠, 徐元林, 赵宁志, 等. 激肽释放酶致固定性药疹一例［j］. 华北国防医药, 2003, 15（6）: 440.

　　［7］ 赵艳霞, 李东明, 王 云, 等. 胰激肽原酶致重症多形红斑药疹［j］. 药物不良反应杂志, 2003, 1（1）: 44-45.