摘要】 目的 以pp2 [4amino5(4chlorophenyl)7(tbutyl) pyrazolo [3,4d] pyrimidine ] 药物（src激酶抑制剂）处理乳腺癌细胞，检测src激酶及ecadherin蛋白表达水平的变化, 观察pp2对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨其可能的机制。方法 pp2处理乳腺癌细胞mdamb231, western blot 检测src及其相关蛋白的表达； boyden小室实验检测细胞侵袭能力； mtt检测细胞的增殖能力。结果 pp2处理mdamb231细胞后, src表达水平明显降低, ecadherin表达水平升高;细胞的增殖和侵袭能力均受到明显抑制，剂量越高抑制作用越明显(p＜0.05) 。结论 pp2通过提高细胞粘附分子ecadherin的表达,从而抑制乳腺癌细胞mdamb231的增殖和侵袭能力。
【关键词】 pp2 侵袭 增殖 乳腺癌
cadherins是一个介导细胞间紧密连接的细胞膜糖蛋白家族。ecaherin是在上皮细胞膜表达的重要cadherin分子。ecadherin的胞浆区域通过细胞质蛋白catenins与细胞骨架的肌动蛋白丝相连，调控细胞形态和运动。在转基因小鼠的研究中发现ecadherin是细胞转移的抑制因子[1]， ecadherin能降低癌细胞的转移能力。wwW.11665.cOM
src是一种膜相关的无需受体的信号传导蛋白激酶，在各类细胞与细胞间的粘附分子接头中大量存在。在肝癌细胞中，ecaherin的异常是被src诱导的[2]。另外，在胰腺癌中，活化src的过表达导致了ecadherin表达下调，刺激细胞的增值和转移[3]。这些现象表明如果把src激酶表达抑制,就有可能使ecaherin表达上调,降低恶性肿瘤的转移。因此，本研究用pp2药物处理恶性肿瘤细胞，然后检测ecadherin表达水平变化及细胞侵袭和增殖能力变化。通过本研究寻找治疗肿瘤转移的新方法。
1 材料和方法
1.1 材料来源 （1）pp2（4amino5(4chlorophenyl)7(tbutyl) pyrazolo [3,4d] pyrimidine）购于sigma公司。（2）src激酶抗体、ecadherin、βactin抗体购于北京中杉公司。
1.2 细胞培养 mdamb231细胞购自美国典型物收藏中心（atcc），用含10％胎牛血清的dmem培养基（gibco公司产品），在5％co2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。
1.3 western blot分析 以三去污细胞裂解液将细胞裂解，参照文献方法[4]提取蛋白。取80μg蛋白质样品进行sdspage电泳、转膜、温封闭1h后，分别加入含0.05％tween 20的tbs缓冲液（tbst）稀释的src igg、ecadherin igg（1∶500）；4℃过夜， tbst漂洗3次，每次10min，加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗（1∶500）；用nbt/bcip/buffer(1∶1∶50)显色系统显色。计算条带的积分吸光度（ia），采用目的条带与βactin的ia值比值表示待测样品的含量。
1.4 mtt试验检测增殖能力 将mdamb231细胞制成细胞悬液，进行细胞记数。将1×104个细胞接种于96孔板，加含10％胎牛血清dmem 200 μl，在37℃、 5％co2的培养箱中培养过夜；第二天分别加入不含pp2的dmem（对照）和含不同浓度的pp2的dmem，每组设6组复孔，培养两天，弃去培养液，1mg/ml mtt溶液加入每孔，培养4h，弃去mtt溶液，每孔加入dmso（二甲基亚砜）中止，振荡15min，于酶标仪上测定560nm波长的吸光度（a）值，计算抑制率（%）=(1－试验组a/对照组a)×100%，并绘制浓度抑制率曲线。
1.5 boyden小室体外侵袭实验检测侵袭指数 8μm孔径聚碳酸酯微孔滤膜（ispi公司）上均匀平铺一层基底膜基质胶（b.d公司）120μg/cm2，37℃放置3h，向下室各孔加入nih3t3细胞无血清培养上清，上室每孔分别加入2×105/ml的细胞悬液（不含血清），每组设6个复孔，常规培养10h；取出膜，拭去膜上层剩余细胞，甲醇固定，苏木精染色，高倍镜下计数膜背面穿膜细胞数，以穿膜细胞百分比反映细胞侵袭力。穿膜细胞百分比＝穿过基质胶覆盖微孔膜的细胞数/穿过无基质胶覆盖微孔膜的细胞数×100％。
1.6 统计学处理 应用spss11.0对试验数据进行分析，行t检验，p＜0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 western blot检测src激酶、ecadherin表达水平 mdamb231细胞用不同浓度[无药物组（control）、1×10-5 mol/l、1×10-4 mol/l、1×10-3 mol/l]pp2处理48h后进行western blot检测。结果显示细胞经pp2处理后csrc蛋白表达水平明显降低，而ecadherin表达水平明显升高，见图1。 2.2 pp2药物处理细胞后体外侵袭能力的检测 boyden小室可以间接的反应癌细胞的侵袭转移能力，本实验用pp2药物处理48h后，以boyden小室实验检测细胞侵袭转移能力的变化。不同浓度(1×10-5 mol/l、1×10-4 mol/l、1×10-3 mol/l)的pp2处理后的穿膜细胞数与无药物组（control）相比，组间比较差异有统计学意义，且药物浓度越高侵袭能力越弱（p＜0.05），见图2。
图1 western blot 检测src激酶、ecadherin表达水平
图2 boyden小室实验检测mdamb231细胞侵袭能力
2.3 mtt检测增殖抑制率 结果显示，经不同浓度[无药物组（control）、1×10-6 mol/l、1×10-5 mol/l、1×10-4 mol/l 、1×10-3 mol/l 、1×10-2mol/l]pp2处理mdamb231细胞两天后，pp2对mdamb231细胞有明显抑制作用，药物的浓度抑制率曲线呈“s”形,符合logistic曲线，见图3。采用综合法计算半数抑制率ic50，结果pp2作用于mdamb231细胞48h的ic50值为0.00583mol/l。另外，高浓度药物组明显比低浓度药组抑制率高，说明pp2对细胞抑制效应具有剂量依赖性。
图3 mtt检测pp2对mdamb231细胞的增殖抑制率
3 讨论
src激酶在大多数恶性肿瘤组织中过表达，如：乳腺癌、肺癌、宫颈癌、皮肤癌、直肠癌、食管癌、胃癌等。有报道称，src在乳腺癌细胞系中的表达高达30%～40%[3]。在外界信号通过细胞表面受体传导入细胞内的过程中， src活化并磷酸化细胞内大量的酶作用底物，通过复杂的信号传导到ecaherin，最终影响细胞间粘附能力。将src激酶作为一种新的抗肿瘤治疗的靶点，寻找抑制src激酶的表达和活性的药物已经成为一个新的研究热点。pp2作为src激酶抑制剂，迄今鲜见其对肿瘤细胞生物学特性的影响及机制的研究。因此，本研究通过pp2药物处理乳腺癌细胞mdamb231，然后检测其增殖和转移能力的变化,从而阐明pp2药物对乳腺癌细胞增殖和转移中的抑制作用。
pp2药物处理后，mdamb231细胞src蛋白的表达水平明显降低，ecadherin表达水平显著增高。boyden小室体外侵袭试验结果表明，用pp2药物处理后的mdamb231细胞侵袭能力降低，且药物浓度越高侵袭能力越弱。mtt试验（四唑盐比色试验）检测mdamb231细胞的增殖情况，结果显示pp2明显抑制细胞的增值。
ecaherin是钙依赖的跨膜糖蛋白，广泛分布予各胚胎来源的上皮细胞[5]。异常的ecaherin系统在良性肿瘤向恶性肿瘤转变中发挥重要作用，ecaherin表达降低，细胞侵袭能力随之上升[6]。本研究结果表明pp2药物提高了ecaherin表达，从而降低恶性肿瘤细胞的侵袭能力。
综上所述，src蛋白激酶抑制剂pp2药物上调ecadherin的表达水平,从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和增殖能力。这些发现为寻找一种新的治疗恶性肿瘤的途径提供了可能。
【参考文献】
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