【摘要】 观察pparγ配体罗格列酮对多柔比星诱导的扩张型心肌病的治疗作用，并探讨可能机制。方法： 30只雄性sd大鼠随机分为（1）正常对照组（con, n=10），等体积生理盐水灌胃；（2）扩张型心肌病组（dcm, n=10），多柔比星2.0 mg·kg-1腹腔注射，每周1次，共8周；（3）扩张型心肌病＋罗格列酮组（dcm+rsg, n=10），罗格列酮3.0 mg·kg-1·d-1灌胃治疗，共12周。第15周检测心肌相关炎症因子浓度以及总抗氧化能力（taoc）、丙二醛（mda）浓度；检测心功能。结果： dcm组与con组相比左室射血分数（lvef），+dp/dtmax，-dp/dtmax，taoc显著降低（p＜0.05）。心肌中tnfα，il1β，il6，mda及胶原容积百分数（cvf）明显升高（p＜0.05），罗格列酮治疗后lvef，taoc有所改善（p＜0.05），tnfα，il1β，il6，mda，cvf有所降低（p＜0.05）。结论： pparγ配体罗格列酮可改善扩张型心肌病大鼠的心功能，其机制可能是提高心肌抗氧化能力、减少炎症因子的释放。
【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 扩张型心肌病 化应激 炎症因子
［abstract］ objective: to observe the effect of administration peroxisome proliferatoractivated receptorγ agonist rosiglitazone on dilated cardiomyopathy (dcm)rats induced by adriamycin and its mechanism.methods： thirty male spraguedawley rats were randomly divided into 3 groups as follows.1)the control group (con, n=10):the same dose of normal sodium was administered by daily gavage.2)the dilated cardiomyopathy group (dcm, n=6): adriamycin was administered intraperitoneally for 8 weeks.3)the dilated cardiomyopathy +rosiglitazone group (dcm+rsg, n=6).concomitant adriamycin and rosiglitazone, rosiglitazone administered daily gavage at a dose of 3mg·kg-1·d-1 for 12 weeks.the concentration of tnfα,il6,il1β,taoc,mda in myocardium were obtained at 15 weeks after treatment.the cardiac function was assessed by echocardiography, hemodynamics at the same time.results： to compare the dcm group with the con group, significantly decrease of left ventricular ejection fraction (lvef), +dp/dtmax,-dp/dtmax and taoc was observed(p＜0.05), while the concentration of tnfα, il1β, il6, mda in myocardium, collagen volume fraction(cvf)were all significantly increased(p＜0.05).lvef, taoc were improved (p＜0.05)by rosiglitazone treatment.concentration of tnfα, il1β, il6,mda in myocardium and cvf were decreased(p＜0.05)by rosiglitazone treatment.conclusion： proliferator activated receptorγ agonist rosiglitazone can improve cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy induced by adriamycin, and the antiinflammatory, antioxidative stress might be two of the mechanisms.
［key words］ pparγ; dilated cardiomyopathy; oxidative stress; inflammatory factor
扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy, dcm）是一种以心脏扩大和左心室或全心收缩功能下降为主要特征的常见心肌疾病，其具体的病理生理机制目前尚不明确。Www.11665.cOm过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ, pparγ）是一类由配体激活的核转录因子，近年研究发现其在心血管系统有表达［1］，同时体内和体外实验均提示pparγ由配体激活后可以改善心室重构［2］。本实验旨在观察pparγ配体罗格列酮（rosiglitazone, rsg）对多柔比星诱导的扩张型心肌病大鼠心功能、心室重构、氧化应激及炎症因子的影响，并探讨其中的可能机制。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 实验动物 健康8周龄雄性sd大鼠30只，体质量（270±20）g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 药品及试剂 多柔比星（浙江海正药业有限公司馈赠）；罗格列酮钠（太极集团馈赠）；氯胺酮（购自江苏恒瑞医药有限公司）；心肌组织tnfα，il1β，il6放射免疫试剂盒（购自北京福瑞生物工程公司）；总抗氧化能力（taoc）、丙二醛（mda）测定试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）；vg染色试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司）。
1.1.3 实验仪器 agilent sonos5500彩超仪，s12型高频超声探头（美国agilent公司）；小动物电生理记录仪（澳大利亚powerlab 公司）；超声波细胞破碎仪（美国branson公司）；核酸蛋白定量仪（德国eppondof公司）；病理切片机（德国leica rm2135）；显微照相及图像分析系统（德国leica qwin3）。
1.2 方 法
1.2.1 动物分组与给药 （1）正常对照组（con组 n=10），生理盐水2.0 ml·kg-1·d-1灌胃，共12周；第5周起使用生理盐水1.0 ml·kg-1腹腔注射，每周1次，至第12周；（2）扩张型心肌病组（dcm组 n=10），生理盐水灌胃同con组，第5周起使用多柔比星2.0 mg·kg-1（2.0 mg·ml-1）腹腔注射，每周1次，至第12周（共8周）；（３）扩张型心肌病+罗格列酮组（dcm+rsg组 n=10），罗格列酮钠3.0 mg·kg-1·d-1（1.5 mg·ml-1）灌胃，共12周，多柔比星腹腔注射同dcm组。多柔比星注射完毕后观察2周，于第15周进行心脏彩超和血流动力学检测，留取标本检测相关指标。
1.2.2 心脏超声检测 氯胺酮（100 mg·kg-1）腹腔注射全身麻醉大鼠，测定体质量，采用s12型探头，频率5～12 mhz，取左室短轴切面，在二维影像指导下用m超测量左室舒张末期内径（lvedd），左室收缩末内径（lvesd），左室射血分数（lvef），左室短轴缩短率（lvfs）。所有指标均在3个连续的心动周期中由2名观察者分别观测，取平均值。
1.2.3 血流动力学检测 大鼠颈部正中切口，分离出右颈总动脉，将软质导管自右颈总动脉插入左心室，尾部连接powerlab八通道生理记录仪的压力传感器，观察并同步记录压力容积曲线（pressurevolume curve，pv），测算左心室压峰值（lvsp）、收缩期dp/dtmax（+dp/dtmax),左室舒张末期压（lvedp）、舒张末期dp/dtmax(-dp/dtmax)。
1.2.4 心室质量及指数测定 血流动力学检测完成后开胸，取出心脏，以4℃肝素生理盐水冲洗，滤纸吸干后称取含室间隔的左心室实际质量（lvaw）、右心室实际质量（rvaw），分别除以体质量后得出左室质量指数（lvwi）和右室质量指数（rvwi）。
1.2.5 心肌组织tnfα，il1β，il6，taoc，mda检测 取心尖部心肌组织约100 mg，充分匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清bca法行蛋白定量，于-80℃保存，按放免试剂盒测定步骤测定tnfα，il1β，il6；按试剂盒说明比色法测定taoc和mda。
1.2.6 组织病理学检测 心脏标本置4%中性甲醛液固定，取左室中段心肌组织2～3 mm厚，常规石蜡包埋、切片，行he染色；按vg染色试剂盒操作步骤行vg染色，用leica qwin3图像分析系统在400倍下行图像分析，每张切片选取4个不重叠视野，计算每个视野中胶原组织所占百分比（心肌胶原容积百分比=胶原面积/全视野面积×100%），取平均数代表cvf。
1.2.7 统计分析 所有数据均以均数±标准差表示，采用spss12.0软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，两组比较用snk法，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 死亡率
con组大鼠无死亡。dcm组共死亡4只，死亡率为40%。dcm+rsg组死亡2只，死亡率为20%，较dcm组明显降低（p<0.05）。
2.2 心脏超声测定结果
与con组相比，dcm组lvedd，lvesd增高（p<0.05），lvfs，lvef均显著降低（p<0.05）；罗格列酮治疗后，lvesd，lvedd，lvfs，lvef均有明显改善（p<0.05）。见表1。 表1 各组大鼠超声心动图及血流动力学检测结果
2.3 血流动力学结果
dcm组lvsp，+dp/dtmax，-dp/dtmax显著低于con组（p<0.05），lvedp高于con组（p<0.05）；使用罗格列酮治疗后lvsp，+dp/dtmax，-dp/dtmax均有所升高，lvedp有所降低（p<0.05），但未恢复正常。见表1。
2.4 心室质量及指数
dcm组lvaw，rvaw，lvwi和rvwi均明显高于con组（p<0.05），罗格列酮可以使lvaw，rvaw，lvwi，rvwi得到改善（p<0.05），但仍高于con组。见表2。表2 各组大鼠心室质量及心室质量指数检测结果
2.5 心肌组织tnfα，il1β，il6测定值
dcm组心肌组织中tnfα，il1β，il6的表达均明显增高。罗格列酮治疗后心肌组织中上述因子的表达水平均有所降低（p<0.05）,见表3。
2.6 心肌组织taoc，mda测定值
dcm组taoc降低，mda增高，使用罗格列酮后mda水平有降低（p<0.05），taoc改善明显（p<0.05）,见表3。表3 各组大鼠心肌组织中tnfα，il1β，il6，taoc，mda测定值
2.7 组织病理学检测结果
大鼠心肌he染色显示dcm组心肌细胞片状变性坏死，心肌细胞明显肿胀、间隙增宽、心肌纤维局限性断裂，淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生；dcm+rsg组心肌细胞仅仅有点状变性坏死，心肌细胞肿胀及淋巴细胞的浸润均有改善，见图1。大鼠心肌vg染色显示在病灶部位出现红色胶原染色，在病灶局部胶原结缔组织增生，间质纤维化，con组仅见少许胶原，dcm组可见胶原大量增生，两组cvf分别为(2.68±0.5)%和(11.55±1.1)%，差异有统计学意义（p<0.05）；dcm+rsg组cvf为(6.91±0.5)%，显著低于dcm组（p<0.05）。见图2。
3 讨 论
罗格列酮是pparγ的特异性配体之一，两者结合后通过与某些基因上游特异的dna反应元件相互作用及非dna结合依赖模式调控基因表达，参与病理生理反应的调节［3］。在对心肌缺血/再灌注、心肌梗死、压力负荷性心衰动物模型的研究中发现pparγ配体对心功能产生了有益作用，但其对扩张型心肌病的作用尚不明确。
本研究采用多柔比星腹腔注射致大鼠扩张型心肌病模型，其lvedd，lvesd，lvwi，rvwi均扩大，lvef，+dp/dtmax，-dp/dtmax下降明显，与人类临床扩张型心肌病特征基本相符［4］。临床研究显示，多柔比星在应用早期就可以通过促进炎症因子的释放和氧化应激通路导致心功能下降［5］，相关炎症因子在心衰早期即可被激活，而且比经典的神经内分泌因子激活更早［6］。因此，我们采用pparγ配体罗格列酮预处理的方法，使得有效的血药浓度覆盖了dcm病理生理变化的整个过程，能在dcm早期进行干预。结果显示，罗格列酮预处理有效改善了dcm大鼠的心室扩张程度和心室重构，使心功能和生存率得到提高。
临床发现扩张型心肌病患者心肌细胞能够分泌tnfα［7］。动物实验也显示超氧化物在扩张型心肌病的叙利亚地鼠中明显升高［8］，pparγ的缺乏可以导致大鼠心肌抗氧化能力的下降，最终进展为扩张型心肌病而死亡［9］。pparγ配体可以有效提高其心室中pparγ蛋白含量，抑制心室肥大、改善心室重构、提高心功能［10,11］，pparγ共活化物的缺乏可以导致心功能的进一步恶化［12］。本组dcm大鼠心肌组织中il1β，il6，tnfα均明显升高，总抗氧化能力下降，心肌坏死明显并伴有大量胶原增生。pparγ配体罗格列酮预处理后dcm大鼠心肌中il1β，il6，tnfα浓度降低，总抗氧化能力提高，心肌细胞坏死减少，心室纤维化得到改善。
诸多相关研究提示：il1β，il6，tnfα的增加促进了大鼠心室中成纤维细胞的活动［13］；增强了基质金属蛋白酶活性，从而促进细胞外基质增生［14］；tnfα亦促进了心肌坏死［15］；机体内氧自由基相对或绝对产生过多，引发脂质过氧化作用，心肌的总抗氧化能力明显下降，心肌出现坏死；这些作用使心脏最终走上病理性重塑。pparγ配体对心肌的保护机制可能是：①通过nfκb，ap1，jnk等细胞通路减少心衰时相关炎症因子的释放，减轻炎症反应［16］，同时，对炎症因子的抑制作用也间接抑制了超氧化物的产生；②通过促进和激活cu/zn-sod的表达来减少超氧化物的生成和抑制nadph氧化酶亚单位p22phox的表达来干预氧化应激反应［17］；③也可以通过诱导型氧化亚氮合酶的表达产生抗氧化作用［18］，从而调控mmp2，mmp3，mmp9的表达，抑制心室纤维化。综上可见，多柔比星导致的扩张型心肌病和其他扩张型心肌病的病理生理过程有相似之处，炎症反应和氧化应激在扩张型心肌病的发生发展中起着极为重要的作用，而pparγ配体预处理可以通过抑制炎症因子的分泌和增强心肌的抗氧化能力对心肌产生保护作用，从而改善心室重构，提高心功能。
在本研究中，罗格列酮对lvedd改善不如lvesd明显，但lvef明显改善，不排除pparγ配体对心肌收缩力的影响，其机制尚待研究。多柔比星导致的扩张型心肌病中，pparγ配体通过哪种通路干预炎症反应和氧化应激，以及对心肌细胞凋亡、电生理重构等的影响尚不甚清楚，有待进一步研究以明确。
【参考文献】
［1］ bishopbailey d.peroxisome proliferatoractivated receptors in the cardiovascular system［j］.br j pharmacol,2000,129(5): 823-834.
［2］ staels b, fruchart jc.therapeutic roles of peroxisome proliferatoractivated receptor agonists［j］.diabetes, 2005,54(8):2460-2470.
［3］ kaplan jm, cook ja, hake pw, et al.15deoxydelta(12,14)prostaglandin j(2)(15dpgj(2)), a peroxisome proliferator activated receptor gamma ligand, reduces tissue leukosequestration and mortality in endotoxic shock［j］.shock, 2005,24(1):59-65.
［4］ 白 洁,陈 蓉,盛 佳.sd大鼠扩张型心肌病模型的建立［j］.江苏大学学报:医学版,2006，16(3)：210-212
［5］ mercuro g, cadeddu c, piras a, et al.early epirubicininduced myocardial dysfunction revealed by serial tissue doppler echocardiography: correlation with inflammatory and oxidative stress markers［j］.oncologist, 2007,12(9):1124-1133.
［6］ kosar f, aksoy y, ozguntekin g,et al.relationship between cytokines and tumour markers in patients with chronic heart failure［j］. eur j heart fail, 2006,8(3):270-274.
［7］ tsutamoto t, wada a, ohnishi m, et al.transcardiac increase in tumor necrosis factoralpha and left ventricular enddiastolic volume in patients with dilated cardiomyopathy［j］.eur j heart fail, 2004,6(2):173-180.
［8］ mollnau h, oelze m, august m, et al.mechanisms of increased vascular superoxide production in an experimental model of idiopathic dilated cardiomyopathy［j］.arterioscler thromb vasc biol, 2005,25(12):2554-2559.
［9］ guoliang d, mingui f, qianhong q, et al.cardiac peroxisome proliferatoractivated receptor γ is essential in protecting cardiomyocytes from oxidative damage［j］.cardiovascular research,2007,7(3)：6269-6279
［10］ henderson bc, sen u, reynolds c, et al.reversal of systemic hypertensionassociated cardiac remodeling in chronic pressure overload myocardium by ciglitazone［j］.int j biol sci, 2007,3(6):385-392.
［11］ shiomi t, tsutsui h, hayashidani s, et al.pioglitazone, a peroxisome proliferatoractivated receptorgamma agonist, attenuates left ventricular remodeling and failure after experimental myocardial infarction［j］.circulation, 2002,106(24):3126-3132.
［12］ arany z, novikov m, chin s, et al.transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking ppargamma coactivator 1alpha［j］.proc natl acad sci u s a, 2006,103(26):10086-10091.
［13］ mitchell md, laird re, brown rd, et al.il1 stimulates rat cardiac fibroblast migration via map kinase pathways［j］.am j physiol heart circ physiol, 2007,292(2):h1139-1147.
［14］ siwik da, chang dl, colucci ws.colucci interleukin1b and tumor necrosis factorα decrease collagen synthesis and increase matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts in vitro［j］.circ res, 2000,86(12):1259-1265.
［15］ setsuta k, seino y, ogawa t, et al.ongoing myocardial damage in chronic heart failure is related to activated tumor necrosis factor and fas/fas ligand system［j］.circ j, 2004,68(8):747-750.
［16］ jacob a, wu r, zhou m,et al.mechanism of the antiinflammatory effect of curcumin: ppargamma activation［j］.ppar res, 2007,2007:89369.
［17］ hwang j, kleinhenz dj, lassègue b,et al.peroxisome proliferatoractivated receptorgamma ligands regulate endothelial membrane superoxide production［j］. am j physiol cell physiol, 2005,288(4):c899-905.
［18］ henderson bc, sen u, reynolds c. reversal of systemic hypertensionassociated cardiac remodeling in chronic pressure overload myocardium by ciglitazone［j］. int j biol sci, 2007,3(6):385-392.
