【摘要】 目的 探讨食管鳞癌（escc）p16基因甲基化的状况及其表达与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法 采用甲基化特异性 pcr方法（msp）分别检测75例食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域cpg岛甲基化状态。采用envision免疫组化法检测食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果 75例标本中，食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因甲基化率分别为41.3 %（31/75）、13.3%（10/75）和6.67%（5/75）。癌组织和癌旁组织p16蛋白的阳性表达率分别为29.3%（22/75）和56.7%(17/30)。31例癌组织p16基因甲基化阳性标本中有2例(6.4% )检测到p16蛋白的表达，而44例癌组织p16基因甲基化阴性标本中有20例(45.5% )检测到p16蛋白的表达。食管癌组织p16基因甲基化率显著高于癌旁组织和切缘组织(p<0.01)，p16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关。p16基因启动子区甲基化与食管癌的组织学分级、肿瘤部位无明显相关，与临床分期、淋巴转移密切相关。结论 p16基因甲基化在食管癌发生发展中起着重要作用，食管鳞癌的分期和淋巴结转移与p16基因甲基化之间有密切关系。
【关键词】 食管鳞 p16基因 dna甲基化 甲基化特异性pcr
食管癌中抑癌基因缺失、突变和蛋白表达等的遗传学机制研究报道比较多见。WWw.11665.cOM然而近来大量研究表明dna甲基化是肿瘤抑制基因失活的重要表观遗传学机制。各种类型肿瘤具有特征性的甲基化模式，不同病人的肿瘤其甲基化模式也可不一样。p16基因是第一个被证明为参与细胞周期调控机制内在成分的抑癌基因，其编码生成的16kd的p16蛋白是细胞增殖的负调节物[1]。为探讨p16基因甲基化在食管癌发生中的作用，我们运用msp方法和envision免疫组化法对食管癌的p16基因甲基化状态及其蛋白表达进行了检测和分析。
1 资料和方法
1.1 一般资料
组织标本来源于食管癌高发地区揭阳及汕头市的2006年5～9月手术切除的食管癌手术新鲜组织标本，包括食管癌组织、癌旁组织和手术切缘黏膜组织各75例。获取新鲜标本后一半迅速冻存于液氮然后转存于-70℃冰箱中，另一半用10％福尔马林固定后送作病理诊断，癌组织石蜡包埋连续切片用于免疫组织化学染色待用。本组75例中男58例，女17例，年龄46～70岁，中位年龄59.2岁。术前均未经放疗和化疗，手术切除后病理证实为鳞状细胞癌，取癌旁黏膜组织以超过癌肿边缘3cm为正常组织。高、中、低分化者分别为19例、31例、25例。tnm分期为ⅱ期22例、ⅲ期34例、iv期19例。分别选取75例食管鳞癌组织及其癌旁组织、手术切缘进行甲基化检测。选取所有癌组织和30例癌旁组织进行p16蛋白免疫组化检测。
1.2 主要试剂与仪器
组织基因组dna提取试剂为北京天为时代科技有限公司产品；甲基化修饰试剂为chemicon公司产品，taq dna热启动聚合酶为qiagen公司产品；pcr 引物由上海生工生物技术有限公司合成。pcr扩增仪为德国personal cycler；凝胶成像系统为美国uvp 8000。鼠抗人多克隆抗体p16为chemicon公司产品，envision试剂盒为dako公司产品。
1.3 方法
1.3.1 组织dna的提取 采用吸附过柱的方法提取组织dna。新鲜组织样品取25mg用液氮碾碎。用蛋白酶k于56℃消化过夜，其余步骤按试剂说明书操作。用核酸蛋白分析仪检测dna的含量和纯度。
1.3.2 dna的亚硫酸氢盐修饰 采用dna cpg岛甲基化修饰试剂盒（cpgenome dna modification kit，chemicon公司，s7820）对dna样品进行亚硫酸氢钠修饰。具体操作按试剂盒说明书进行。取1.0μg dna样品溶于100μl h2o中，加入7.0μl 3m naoh，50℃温育10min。加入550μl新鲜配制的dna修饰试剂ⅰ，振摇后于50℃避光温育4～16h。然后进行脱盐、去磺基、二次脱盐，最后用25μl的te把dna洗脱下来。
1.3.3 pcr扩增 按照文献[2]设计两对引物，见表1。分别为p16的特异性甲基化引物（p16-m）和p16的特异性非甲基化引物（p16-u）对修饰后的dna样品作pcr扩增。每个pcr反应体积为25μl，内含：1.5mmol/l的mgcl2；200μmol/l的dntps，200nmol/l的引物，经亚硫酸氢盐修饰的dna样品1μl。pcr反应条件：95℃ 15min，95℃ 40s，62℃ 40s， 72℃ 40s，共40个循环，最后72℃ 10min。以p16基因甲基化的人结肠癌细胞系rko提取的dna样品作为阳性对照，以p16基因非甲基化的人胃癌细胞系mgc803提取的dna样品作为阴性对照。
1.3.4 pcr产物分析 取8μl pcr产物于2.0%的琼脂糖凝胶中，100v电泳约30min。于凝胶成像系统中进行成像分析。判定标准：如果m引物扩增出234bp条带，u引物未扩增出条带，说明p16基因启动子区5′cpg发生了纯合型甲基化；反之即未发生甲基化；若m、u均扩增出相应大小的条带，说明存在杂合型甲基化状态，见图1。
1.3.5 免疫组织化学检测p16蛋白的表达 石蜡切片经脱蜡、水化；ph 6.0柠檬酸缓冲液中微波抗原修复15min；0.3%过氧化氢 5min；滴加效价为1∶50的一抗温育30min；多聚物二抗envision温育30min；dab显色，苏木素复染；以pbs代替一抗作阴性对照, 已知p16阳性的宫颈癌切片做阳性对照。阳性细胞判断方法：肿瘤细胞核和(或)胞浆被染成黄褐色、呈现粗细不等、深浅不一的颗粒状。判定标准:阳性细胞数<20%为阴性,阳性细胞数>20%为阳性。
1.3.6 统计学处理 应用spss软件，采用两样本率的χ2检验或者fisher′s确切概率法。p<0.05为差异有统计学意义。表1 p16基因启动子区甲基化检测引物
引物对正向引物 5′→ 3′反向引物5′→ 3′扩增片段（bp）基因位点p16－wcagagggtggggcggaccgccgggccgcggccgtgg140+171p16－mttattagagggtggggcggatcgcgaccccgaaccgcgaccgtaa243+167p16－uttattagagggtggggtggattgtcaaccccaaaccacaaccataa243+167
m：用p16m特异性引物进行扩增；u：用p16u特异性引物进行扩增；1.新鲜癌组织；2.新鲜癌旁组织；3.石蜡癌组织；4.rkd dna（阳性对照）；5.mgc803 dna（阴性对照）；6.空白对照；m:100bp dna ladder
图1 msp法检测不同组织中p16基因的甲基化状态
2 结果
2.1 p16基因甲基化检测结果
本组研究中75例食管切缘组织和相应癌旁组织分别有5例（6.67%）和10例（13.3%）检测到甲基化，均为杂合型甲基化； 75例食管癌组织中31例检测到甲基化(41.3%)，其中纯合型甲基化23例，杂合型甲基化8例。癌组织与癌旁组织（χ2 =14.8）、癌组织与手术切缘组织(χ2 =24.7)之间的差异均有统计学意义(p<0.01)，见表2。表2 p16基因启动子区甲基化检测结果
2.2 p16基因甲基化与食管癌临床病理特征的关系 见表3。 表3 p16基因启动子区甲基化阳性率与食管癌临床病理特征的关系*：与低分化组相比；**：与胸中段组相比
2.3 p16基因甲基化及与p16蛋白表达的关系
随机检测本组30例癌旁组织p16蛋白阳性表达率是56.7%（17/30），而75例癌组织p16蛋白的阳性表达率仅为29.3%（22/75），癌组织的p16蛋白表达率明显低于癌旁组织中蛋白的表达率（p<0.05）。按免疫组化结果将病例分为p16蛋白表达阴性组和阳性组进行甲基化分析，结果显示:在食管鳞癌组织中p16基因启动子区甲基化状态与p16蛋白表达呈明显负相关（p<0.01），见表4。表4 食管鳞癌组织中p16基因启动子区 甲基化与p16蛋白表达的关系
3 讨论
目前已经明确食管癌的发生是多因素、多阶段、多基因参与的过程。因此，寻找食管癌诊断和防治的早期分子标志物，对高危人群进行筛查，准确判断预后，提供靶基因治疗位点，从而对预防和治疗食管癌都将产生积极的意义。研究表明p16基因的表达产物能特异性地在g1调控点中与cyclind1竞争结合cdk4/6，抑制cyclind1/cdk 4/6复合物的蛋白激酶活性，阻止细胞通过g1/s期限制点进入s期，细胞停滞在g1期，从而使细胞的生长受到抑制。p16基因缺失、突变或启动子区异常甲基化后，p16蛋白的失表达即不能有效的抑制cyclind1/cdk 4/6复合物的活性，使细胞生长周期失控变成无限制扩增、分裂、生长, 最终向肿瘤发展和转化[3]。
随着肿瘤发生表观遗传学机制研究的进一步深入，p16基因启动子区域甲基化可能是其失活的主要原因之一。其甲基化dna序列可通过干扰转录因子与dna附着、直接结合转录抑制因子、影响dna空间构象以及诱发ct突变等多种机制影响其基因表达[4]。多项研究证实，p16基因甲基化与多种恶性肿瘤的发生有关[5,6]。而且在食管鳞状细胞癌中，p16基因的突变或缺失率极低[7]。有研究认为p16基因启动子区异常甲基化在食管鳞状细胞癌家系和腺癌中存在较高的频率[8,9]。
本组75例食管癌标本中31例检测到甲基化(41.3%)，而相应的癌旁组织有10例甲基化（13.3%），甲基化阳性率差异有统计学意义，提示p16基因异常甲基化在食管癌中是一高频事件。本研究免疫组化表明， p16基因甲基化阴性标本中基因的表达率显著高于甲基化阳性的标本。p16基因甲基化和p16蛋白表达之间呈显著负相关(p<0.01)，而且p16基因甲基化与癌组织的分化和肿瘤分期密切相关，提示p16基因甲基化是该基因在食管鳞癌中失活的一种重要机制，在食管癌发生发展过程中发挥着重要作用。另外，本组研究中癌组织p16蛋白的缺失率高于基因的甲基化率，也证实了p16基因还可能存在突变、缺失等其他原因的失活机制[10]。
msp原理为亚硫酸氢盐对dna进行修饰处理后，dna中的c变成u，如果被检测基因已经发生cpg岛甲基化则不能发生此变化，针对修饰后的dna设计甲基化和非甲基化两对引物进行pcr，即可确定目的基因有无cpg岛甲基化。msp避免了原来由限制性内切酶区分甲基化和非甲基化的dna的pcr方法所引起的假阳性。修饰后的样本dna也应在尽可能短的时间进行pcr扩增，以防样本dna降解而使扩增效率降低。本研究发现部分甲基化阳性的病例中也检测到了非甲基化特异性产物的扩增。可能是因为肿瘤组织内往往多混有其他类型的正常细胞，或者是由于等位基因中一个甲基化而另一个未甲基化形成半甲基化或杂合型甲基化状态，因此部分病例扩增出u引物相应的条带。同时半甲基化状态也提示甲基化过程可能是一个致癌物作用于p16基因的量的积累过程。因此它的检测可能对食管癌的预防有积极的意义。
本组中有5例切缘组织和10例癌旁组织发现p16基因甲基化，病理检查并未见癌浸润，其中1例切缘和4例癌旁组织有中、重度不典型增生，这提示p16基因甲基化在癌发生之前就可能存在，p16基因甲基化导致p16基因失活是食管癌发生过程中的早期分子事件。因此p16甲基化的检测可能为评估术后切缘复发提供必要的分子生物学参考依据。
本组结果还显示，p16基因启动子区甲基化程度与癌组织分化程度、肿瘤的部位无明显相关，但与肿瘤tnm分期、淋巴结转移上差异均有显著性，晚期肿瘤和淋巴转移组p16基因甲基化率显著高于分期较早和淋巴结未转移组。提示p16基因甲基化异常可能与食管癌患者的临床生物学行为和预后有关，由于本组患者术后时间尚短，生存期仍在随访观察中，是否可作为判断食管癌预后的参考指标有待进一步扩大样本量进行研究。
研究表明，肿瘤的发生是环境因素和基因相互作用的结果。甲基化是把二者联系起来的重要因素之一，环境中包括n亚硝基化合物在内的许多致癌物能使dna烷基化，其中最重要的就是使得抑癌基因没有甲基化的启动子区域产生异常甲基化[11]。p16基因启动子区5′cpg岛在环境致癌因素的作用下发生甲基化后，其基因失表达，不能发挥正常的抑制细胞生长的作用，从而促进了肿瘤的发生和发展。目前有研究对p16基因cpg岛甲基化并表达沉默的肿瘤细胞系，应用52′脱氧胞苷(5 aza 2′dexycytidine)去甲基化处理后，使肿瘤细胞重新恢复了p16蛋白的表达，并出现肿瘤细胞生长抑制[12]。因此p16基因甲基化的检测不仅使其有可能成为肿瘤评估的指标之一，而且为食管癌的去甲基化预防和去甲基化治疗提供重要的理论依据。
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