【摘要】 目的 表达犬细小病毒vp2 蛋白（cpv vp2），用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和vp2 蛋白功能研究。方法 采用pcr方法对cpv vp2基因进行扩增，将cpv vp2基因克隆到毕赤酵母 (pichia pastoris) 分泌表达载体ppiczαa中，构建真核重组表达载体ppiczαavp2，将该重组质粒线性化后，转化毕赤酵母菌gs115中，在甲醇诱导下表达cpv vp2，sdspage和western blotting鉴定表达蛋白。结果 成功扩增了cpv vp2基因，构建了真核重组表达载体ppiczαavp2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kd蛋白。western blotting鉴定表明，表达vp2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论 在毕赤酵母中成功地表达了cpv vp2蛋白，能被犬细小病毒阳性血清识别。
【关键词】 犬细小病毒vp2基因 毕赤酵母 真核表达
cloning of vp2 gene of canine parvovirus and expression in pichia pastoris
zhang yunxia1，ding yinqiao2，zhao tiezhu2，yang lu2，sun ming2，
cao zhen2，wang chuanbin2，chen xizhao2，tian kegong2
(1. college of veterinary medicine of chinese agriculture university，beijing 100094；
2. national veterinary diagnostic center of ministry of agriculture，beijing 100094，china)
【abstract】 objective to establish a yeast pichia pastoris expression system expressing canine parvovirus vp2 protein (cpv vp2) to serve the diagnosis of cpv，development of cpv vaccine and research of vp2 protein function. methods cpv vp2 gene was amplified by pcr，cloned into secretory pichia pastoris expression vector ppiczαa，and was constructed into eukaryotic expression vector，which was named ppiczαavp2. after being linearized with enzyme digestion，the vector was transformed into pichia pastoris gs115 by electroporation method. the cpv vp2 protein expressed with methanol induction. the expressed protein in yeast was analyzed by sdspage and western blotting. results cpv vp2 gene was successfully amplified，sdspage and western blotting analysis of the culture supernatants showed that the vp2 protein of 64.35 kd was expressed in pichia pastoris，and the expressed cpv vp2 protein shared reaction with positive serum against cpv. conclusion cpv vp2 has been successfully expressed in yeast pichia pastoris. the expressed cpv vp2 protein shares reaction with positive serum against cpv.
【key words】 cpv vp2 gene; pichia pastoris; eukaryotic expression
犬细小病毒（canine parvovirus，cpv）是细小病毒科细小病毒属成员。Www.11665.COM犬感染可引起犬出血性腹泻和心肌炎，血液中的白细胞大量减少，症状与猫泛白细胞减少症相似，在幼犬中的发病率和死亡率都很高，是危害我国养犬业最为严重的传染病之一，可造成成巨大的经济损失。
病毒基因组主要编码两种结构蛋白：vp1和vp2，vp1基因全长2256cnt，vp2基因全长1755cnt，vp1c端氨基酸和vp2蛋白的n端氨基酸序列相互重叠。vp1和vp2蛋白在病毒感染过程中起着极为重要的作用。vp2基因编码cpv的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体，vp2蛋白具有血凝活性［1］。表明vp2蛋白具有用于cpv病预防免疫的潜能，同时还可能在cpv病的诊断与免疫评价上具有重要作用。本研究利用pichia pastoris酵母表达系统表达cpv vp2蛋白。将为cpv病的诊断和疫苗研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 毒株、菌株和载体： 本文所用的cpv北京毒株由农业部兽医诊断中心保存。e.coli jm109感受态细胞购自promega公司，c表达载体ppiczαa、毕赤酵母gs115菌株及抗生素zeocintm购自invitrogen公司。
1.1.2 主要试剂、试剂盒及培养基：限制性内切酶ecorⅰ、xbaⅰ、sacⅰ、dna maker购自大连宝生物技术有限公司；taq dna polymerase、dntp、t4dna连接酶购自promega公司。小量胶回收试剂盒、酵母基因组dna提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司，质粒纯化试剂盒购自博大泰克公司，低盐lb、ypd、mdh、mmh、bmgy、bmmy等培养基均按照invitrogen公司毕赤酵母表达说明书配制［2］。辣根过氧化酶标记羊抗犬酶标二抗购自中杉公司。
1.1.2 引物: 根据已发表的cpv的vp2基因dna序列，利用primer 5.0软件设计一对引物，上游引物中含有ecori限制性酶切位点，下游引物中含有xbai限制性酶切位点，重组表达质粒的pcr鉴定所用引物根据表达载体ppiczαa上的5′aox1和3′aox1引物位点合成，引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下： 上游引物vp2f：5′gcgaattcatgagtgatggagcagtt3′;下游引物vp2r： 5′actctagatataattttctaggtgc3′; pcr鉴定引物：5′aox1：5′gactggttccaattgacaagc3′; 3′aox1：5′gcaaatggcattctgacatcc3′; 使用液浓度为10 pmol/μl。
1.2 方法
1.2.1 cpv dna 的提取： 采用酚氯仿异戊醇方法提取病毒dna，沉淀用50 μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。
1.2.2 pcr扩增vp2基因： 以上步提取的dna为模板，利用特异性引物vp2f/vp2r扩增vp2基因。pcr反应体系20 μl：ddh2o 8 μl，10×pcr buffer 2 μl，2.5 mmol/l dntp 2 μl，15 mmol/l mg2+ 2 μl，10 pmol/μl目的基因上下游引物混合液2 μl，0.5 u/μl taqdna聚合酶2 μl，cpv dna模板2 μl。反应条件为95℃预变性8 min；94℃变性2 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环后，72℃延伸10 min。95℃预变性8 min后立即加入taqdna酶。pcr产物在1%琼脂糖凝胶中电泳。
1.2.3 表达载体ppiczαavp2的构建: 以cpv dna为模板，用引物vp2f/vp2r进行pcr扩增获得cpv vp2基因片段。pcr扩增片段用ecori和xbai双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，将cpv vp2基因片段克隆入穿梭质粒ppiczαa的ecori和xbai酶切位点，并转化jm109感受态细胞。酶切、连接、转化及质粒dna的制备方法均按文献进行［3］。
1.2.4 重组表达质粒的pcr鉴定: 反应体系为20 μl，引物为 5′aox1和3′aox1；反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后，72℃延伸10 min。
1.2.5 重组表达质粒的酶切鉴定: 用限制性内切酶ecorⅰ和xbaⅰ对ppiczαavp2重组表达质粒进行双酶切。
1.2.6 重组表达质粒的序列测定: 重组表达质粒的序列测定由北京生物工程技术有限公司完成。
1.2.7 重组表达质粒转化毕赤酵母gs115:采用电穿孔法，制备毕赤酵母gs115感受态细胞［4］。将重组表达质粒ppiczαavp2用saci单酶切线性化后，用life technologies电转仪在参数为2.5 kv、25 μf、200 ω条件下进行电击，立即加入1 ml预冷的1 mol/l山梨醇混匀，29.5℃温箱温浴1 h，将温浴后的产物涂布于含有100 μg/ml zeocintmypds平板，于29.5℃温箱培养3～4 d。
1.2.8 酵母转化子的表型筛选: 在mmh平板上与mdh平板上生长速度一致的重组子为甲醇利用正表型（mut+表型）；在mdh平板上生长速度快，而在mmh平板上生长速度慢的重组子为甲醇利用慢表型（muts表型）。将转化子进行表型筛选。
1.2.9 酵母转化子的pcr鉴定: 挑取数个重组子，按酵母dna提取试剂盒说明书抽提酵母转化子基因组dna作为模板，进行pcr鉴定。
1.2.10 重组酵母菌株的表达及鉴定:
1.2.10.1 重组酵母菌株的表达: 将筛选的阳性转化子接种到酵母菌100 ml bmgy培养基中29.5℃，280 r/min，振荡培养至菌液浓度a600值达3～6时，25℃、3 000 r/min，离心5 min后收获菌体沉淀，用10 ml bmmy重悬酵母菌体进行诱导表达。每隔12 h取样并同时补加0.5%的甲醇和0.004%的组氨酸。
1.2.10.2 重组表达蛋白的sdspage分析: 取培养液上清进行sdspage后，用考马斯亮蓝r250染色，并用紫外凝胶成像系统照相。
1.2.10.3 重组表达蛋白的western blotting鉴定: 将sdspage电泳产物转移至硝酸纤维素膜上，用10％马血清4℃过夜封闭，用兔抗cpv阳性血清1∶50稀释作为一抗，以1∶5000稀释的羊抗兔酶标igg作为二抗，经dabh2o2显色后，观察结果。
2 结果
2.1 vp2基因的扩增
以酚氯仿异戊醇方法提取的病毒dna为模板，用引物vp2f/vp2r进行pcr扩增后，在1 755 bp处可见目的条带，大小与预期相符，结果见图1a。
2.2 重组表达质粒ppiczαavp2的构建与鉴定
2.2.1 重组表达质粒的pcr鉴定: 重组表达质粒ppiczαavp2用载体引物5′aox，3′aox和目的基因vp2引物vp2f/vp2r分别扩增目的基因，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，于2 276 bp和1 755 bp 左右各出现一条核酸带（图1b），表明vp2基因已克隆到ppiczαa中，命名为ppiczαavp2。将ppiczαavp2送大连宝生物工程公司进行序列分析，确认cpv vp2序列正确。
2.2.2 重组表达质粒的双酶切鉴定: 将重组表达质粒ppiczαavp2用ecorⅰ和xbaⅰ双酶切，核酸电泳鉴定后得到约1 755 bp dna条带，与预期大小一致，结果见图2。
2.2.3 重组表达质粒ppiczαavp2整合入酵母菌株中的pcr鉴定结果:提取酵母基因组dna作为模板，用引物5′aox1/3′aox1和vp2f/vp2r分别进行pcr鉴定。结果重组酵母菌株扩增出2276 bp和1755 bp的目的带，对照菌株仅扩增出589 bp的对照带，与预期大小一致。见图3。
2.3 vp2基因在酵母菌中的表达分析
以线性化的ppiczαavp2转化酵母菌，将pcr鉴定阳性的单个菌落于bmmy酵母培养基29.5℃摇瓶培养96 h后，取上清进行sdspage 分析。结果表明在64.35 kd处出现目的蛋白条带（图4）。使用cpv阳性血清，对上述表达的蛋白产物进行蛋白印迹分析，结果在64.35 kd处的特异性条带能与cpv病毒阳性血清发生特异性反应（图5）。说明表达的vp2蛋白具有良好的反应原性。
3 讨论
酵母表达系统是用来表达复杂蛋白的一类较为理想的表达系统，在基因工程产品产业化生产中具有很好的商业前景。迄今，国内外已有很多外源蛋白表达成功的例子，如乙肝表面抗原、破伤风毒素片段c、肿瘤坏死因子（tnf）、人溶菌酶、胰岛素前体、图1a cpv vp2基因的扩增与原核表达系统相比，本研究所用毕赤酵母表达系统表达的蛋白具有以下优点：1.表达的外源蛋白具有天然蛋白的生物活性；2. 外源蛋白不形成包涵体，可直接分泌到胞外；3. 自身分泌蛋白非常少，外源蛋白带有6his组氨酸标签，有利于重组蛋白的纯化。
杨玲等［11］研究表明将cpv vp2基因克隆到pgex6p1载体中，经iptg诱导并不能获得目的蛋白表达，必须将全基因分段表达，但分段表达产物不具备vp2完整蛋白的生物学特性。国外学者研究表明，cpv vp2基因在真核表达系统杆状病毒中能成功获得表达。国内学者王玉玲等［12］利用真核表达系统杆状病毒成功构建了真核表达质粒pmel baccvp2。本研究利用毕赤酵母 pichia pastoris分泌型表达载体ppiczαa构建成功的重组酵母表达质粒ppiczαavp2，成功地表达了cpv vp2蛋白，初步试验证明表达的vp2蛋白具有反应原性。
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