【摘要】 目的 检测中国汉族人群il27p28基因启动子区域一个单核苷酸多态位点964a＞g的多态性，探讨该位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法 采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(pcrrflp）法检测360例哮喘患者和220例正常对照者il27p28基因启动子区域单核苷酸多态位点964a＞g的基因型，计算基因型频率和等位基因频率，对比分析两组基因频率和基因型频率分布。结果 il27p28基因启动子区域964a＞g位点在中国汉族人群中具有多态性，其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合hardyweinberg平衡，基因型aa、ga和gg的频率在病例组分别为0.4028、0.4205和0.1722，在对照组中分别为0.4318、0.4455和0.1227; 该位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组间的差异均无统计学意义(p=0.274)，提示该多态位点与中国汉族人群哮喘无显著相关性。结论 il27p28基因启动子区域单核苷酸多态964a＞g与中国汉族人群支气管哮喘易感性没有显著相关性。
【关键词】 支气管哮喘 白细胞介素27 单核苷酸多态 th细胞 关联分析
promoter region and asthma in a chinese han population
qiu rongfang1, li jisheng1, gao guimin1, guo chenhong1,
li huaichen2, wei chunhua3, liu qiji1
(1. key laboratory of experimental teratology, ministry of education, institute of medical genetics, school of medicine,
shandong university, jinan 250012, china; 2. department of respiratory internal medicine, provincial hospital affiliated to
shandong university, jinan 250012, china;3. weifang asthma hospital, weifang 261041, shangdong， china)
to genotype a single nucleotide polymorphism (snp), 964a＞g, in the il27p28 gene promoter region and evaluate the association between snp and asthma susceptibility in a chinese han population from shandong province. methods snp 964a＞g was genotyped in 360 asthma patients and 220 healthy controls by using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (pcrrflp) method. the chisquare test was used to evaluate the hardyweinberg equilibrium. allele frequencies and significance values were analyzed by using spss13.0 software. results snp 964a＞g was genetically polymorphic in the chinese han population. the distribution of this snp was at hardyweinberg equilibrium in both asthma patients and healthy controls. the frequencies of genotypes aa, ga, and gg at 964a＞g site were 0.4028, 0.4205, and 0.1722 in the asthma patients, while 0.4318, 0.4455, and 0.1227 in the healthy controls. no statistically significant difference was observed in the distribution of genotype and allele frequency between asthma patients and healthy controls (all p＞0.05). conclusions snp 964a＞g in the il27p28 gene promoter region is not associated with asthma in the chinese han population, il27p28基因启动子区域964a＞g位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性key words： asthma; interleukin 27p28; single nucleotide polymorphism; association study 支气管哮喘是最常见的由遗传因素和环境因素相互作用引起的复杂疾病［1］。wWw.11665.com目前通过连锁分析、定位克隆以及候选克隆等方法证实多个基因或染色体区段（如5q2135,6p21,11q13等）与支气管哮喘相关［2］。支气管哮喘作为一种免疫相关疾病，以th1/th2细胞（thelper lymphocyte type 1/2）分化不平衡为主要特征，属于th2型免疫反应，存在向th2细胞免疫偏离［3］。il27是2002年发现并命名的一种新的il12家族异二聚体细胞因子，在抗感染免疫抗肿瘤免疫及自身免疫性炎症等th1型免疫主导的病理过程中起重要作用。它由新鉴定的螺旋亚基p28［4］和可溶性细胞因子受体eb病毒诱导基因3（epsteinbarr virusinduced gene3,ebi3）表达产物通过二硫键组成， 而p28是t细胞生长和分化的一个重要候选基
1 资料与方法
1.1 研究对象 本研究分析的dna样本是由山东大学医学遗传学研究所收集并保存的用于哮喘病例对照研究的dna样本［6］。病例组360例，其中男165例，女195例，平均42.99岁，所有患者均符合支气管哮喘诊断标准，即：①反复发作喘息、气急、胸闷或咳嗽；②发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；③上述症状可经治疗缓解或自行缓解；④症状不典型者（如无明显喘息或体征）应至少具备以下一项试验阳性：支气管激发试验或运动试验阳性；支气管舒张试验阳性［1秒钟用力呼气容积（forced expiratory volume 1, fev1）增加15％以上，且fev1增加绝对值＞200ml］；最大呼气流量（peak expiratory flow, pef）日内变异率或昼夜波动率≥20％；⑤除外其它疾病所引起的喘息、气急、胸闷和咳嗽。对照组220例，其中男160例，女60例，平均39.16岁，均为无血缘关系的汉族个体，来自山东大学附属省立医院健康查体者，无过敏性哮喘及其他过敏性疾病症状及病史，排除肝、肾疾病。
1.2 方法 采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态（pcrrflp）法分析964a＞g位点的基因型。
1.2.1 引物设计与合成 根据ensembl human geneseqview上找到的il27基因序列（chr16:2841818428425656），用软件primer5.0设计用于扩增包含964a＞g位点的一对引物，引物序列为：f5′tcggcagatgttggtattt3′, r5′agagtcatctgactcccttatg
gtt3′,扩增产物长度为842bp。
1.2.2 pcr扩增 pcr反应体系中含：5×pcr buffer 4μl ，5×dntp(datp、dttp、dgtp和dctp各1mmol/l)4μl，引物f(10μmol/l) 0.25μl，引物r（10μmol/l） 0.25μl，mg2+（25mmol/l） 0.5μl，taq dna聚合酶（5u/μl） 1μl，基因组dna(20ng/μl)2μl，最后用灭菌三蒸水补至20μl。pcr扩增反应条件：首先94℃预变性4min，然后进行“94℃变性40s，5℃退火40s，72℃延伸40s"循环，共37个周期，最后在72℃延伸10min；取pcr产物5μl，加上样缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（ethidium bromide, eb）染色观察，根据电泳图确定是否得到目的片段。
1.2.3 pcr产物酶切 根据目的片段中的酶切位点选取限制性内切酶taq i对pcr产物进行酶切， g等位基因的扩增片段可以被限制性内切酶taq i切成368bp和474bp的2个片段，而a等位基因的扩增片段不能被切开。限制性内切酶酶切体系为20μl，其中包括pcr产物10μl，10×酶切缓冲液2μl，限制性内切酶taq i 2u,用灭菌三蒸水补至20μl，混匀后加入10μl石蜡油；65℃水浴内消化3.5h；取酶切产物10μl，加上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳，eb染色观察，根据电泳图确定基因型。
1.3 统计学处理 检测hardyweinberg平衡确定病例组与对照组是否均处于遗传平衡状态，并利用spss 13.0 软件进行χ2检验以分析多态位点在两组间的基因型频率及等位基因频率差异,以p＜0.05为差异具有统计学意义。若此多态位点的基因型频率及等位基因频率在组间具有统计学差异，说明该多态位点与哮喘具有相关性，反之则与哮喘无相关性。
2 结 果
2.1 基因分型 采用pcr方法扩增包含该多态位点的dna片段，均得到了预期大小的扩增片段。扩增产物经taq i酶切，酶切产物电泳结果见图1。对于aa基因型个体，片段中不含酶切位点，因而只能检测到842bp这1条条带, 而对于gg基因型，片段中含有taq i酶切位点，酶切产物可见368bp和474bp 2条条带；ga基因型则可检测到未被酶切的842bp以及酶切产生的368bp和474bp共3条条带。根据酶切产物电泳结果，记录各个体基因型，见表1。
病例组对照组p值aa145(40.28)ga153(42.05)0.274gga443(61.53)288(65.45)g277(38.47)152(34.55)0.751
2.2 hardyweinberg平衡吻合度检验 病例组与对照组964a＞g位点的基因型分布符合hardyweinberg平衡，其p值分别为p=0.0523和p=0.8241。
2.3 相关性检验 见表1。该位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组间的差异均无统计学意义(p=0.274，p=0.751)，提示该多态位点与中国汉族人群哮喘没有显著相关性。
3 讨 论
th1/th2细胞功能异常或失衡是引起多种免疫疾病的重要因素。th2细胞的优先诱导可以抑制自身免疫性反应［78］，而th1细胞的优先诱导则可以影响哮喘等过敏性疾病的发生［910］。现有研究［11］证实，哮喘患者th2细胞功能亢进，th1细胞功能降低。il27是th1类细胞因子，由可溶性受体ebi3和螺旋状蛋白il27p28两个亚基组成，通过广泛表达于各种免疫细胞表面的il27受体wsx1/gp130发挥生物学效应。其在感染的早期通过多种机制启动初始cd4+t细胞向th1细胞分化, 而在高度th1极化的情况下，能限制th1型免疫反应的强度和持续时间，保护机体免受过度免疫反应带来的损伤［12］。因此il27与哮喘的发生密切相关。
2005年shimizu s等［13］研究发现，与野生型小鼠相比，wsx1(-/-)小鼠的气道免疫反应和血清ige水平明显升高，同时伴随着肺部嗜酸性细胞的浸润，表明通过对细胞因子产生的抑制作用，il27/wsx1在过敏性哮喘的发展过程中对降低气道高反应性和肺部炎症有着重要的作用。所有这些研究充分表明，il27是一个重要的哮喘候选基因，但这需要在多个人群中进行验证分析。2007年chae等［5］韩国学者首次研究了包括964a＞g位点在内的4个多态位点与韩国人群哮喘易感性之间的关系，发现964a＞g位点的多态性与韩国人群哮喘易感性密切相关，2905t＞g, 4603g＞a和4730t＞c这3个snp位点构成的单体型与韩国人群哮喘易感性之间也存在相关性。虽然证实il27p28单核苷酸多态在韩国人群中与哮喘易感性相关，但是在中国人群中是否相关还是未知数。
位于基因调控区域的多态位点由于可能改变了转录因子的结合位点从而影响基因的表达，基因表达的上调或下调，引起一系列的生物学效应，在疾病的发生中起着重要的作用。为了探讨il27p28基因启动子区域单核苷酸多态与中国汉族人群哮喘的相关性，本研究对汉族人群的964a＞g位点进行相关性分析，研究结果表明，该位点的基因型频率及等位基因频率在病例组和对照组间的差异无统计学意义（p=0.274），提示该snp位点与中国汉族人群哮喘不相关。本研究检测到的964a＞g位点结果与韩国学者报道的结果相反，其原因可能是多方面的，如该位点与哮喘易感性之间的关系可能具有种族特异性，从而导致该位点在不同人群中重复性较差。另外也有可能本研究的哮喘病例纳入标准与韩国学者研究的样本纳入标准不同，这些都可引起结果的差异，有待进一步的分析证实。同时，尽管未发现汉族人群il27p28基因964a＞g位点与哮喘之间存在相关性，但是并不能代表il27基因与哮喘不相关，即不能排除该基因其它多态位点可能与哮喘相关，因为il27p28基因在t细胞生长分化中起着重要作用，而且il27基因的配体之一wsx1基因是一个重要的哮喘易感基因, 所以需要更多的研究来阐明il27p28基因的功能以及它与哮喘及其他免疫相关疾病之间的关系。
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