【摘要】 目的: 评价酪蛋白裂解酶p(clpp)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（spn）中的表达情况. 方法: 以tigr4型spn的clpp基因序列设计引物，分别以12株不同血清型spn的基因组dna为模板，对clpp基因进行聚合酶链反应(pcr)扩增、胶回收产物与pmd18克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用western blot方法检测12株不同血清型spn的clpp蛋白的表达情况. 结果: 12株不同血清型spn的clpp基因序列和genbank数据库对已公布的tigr4型spn的clpp基因一致性>99.0%，推测的氨基酸序列一致性>99.5%. western blot结果显示anticlpp多克隆抗体与12型spn的菌体蛋白能够起交*反应. 结论: clpp蛋白在不同型spn之间同源性高，在不同型spn菌株中均有表达. clpp是一个具有前景的spn候选蛋白疫苗因子.
【关键词】 肺炎链球菌；clpp基因；序列分析；抗原性
0引言
肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，spn）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌. 随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗在预防和控制spn感染中的作用越来越重要［1］. spn根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型spn都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前spn疫苗的发展方向. 研究发现的spn蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶p(caseinolytic protease p, clpp）是atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶［2］，其在spn的生存、致病和入血过程中起着重要的作用［3-4］，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值. 本研究探讨clpp在不同spn菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型spn中表达情况，旨在为自主开发spn蛋白疫苗奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌种与质粒12株不同血清型spn： cmcc(b)31 109(serotype 1)，cmcc(b)31 203(serotype 3)，cmcc(b)31 446(serotype 4)，cmcc(b)31 011(serotype 5)，cmcc(b)31 207(serotype 6b)，cmcc(b)31 507(serotype 7f)，cmcc(b)31 216 (serotype 9v)，cmcc(b)31 614 (serotype 14)，cmcc(b)31 687(serotype 18c)，cmcc(b)31 693(serotype 19f)，cmcc(b)31 759(serotype 23f)（北京中国医学细菌保藏管理中心），nctc7466 (serotype 2，国际通用名为d39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌dh5a和原核表达系统(含pet32a(+)/clpp重组质粒)e.coli bl21(de3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒pmd18t载体试剂盒(日本takara公司).
1.1.2试剂dna提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒dna快速制备试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶ecori，saci，高保真la taq聚合酶，dntps，buffer，mgcl2(大连宝生物技术公司)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基βd硫代半乳糖苷(iptg)，完全弗氏佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)(美国sigma公司)；dna marker(上海生工公司)；goatantimouse igg hrp(h+l)和3二氨基苯联胺dab∶3(北京中杉公司)；咪唑，nacl和tris碱(美国bbi公司)；his bind column(ninta)镍柱(美国novagen公司).
1.1.3仪器热循环仪（tmbiorad pcr，美国gene cycle公司）； 电泳仪（power/pac200，美国biorad公司）.
1.1.4动物balb/c小鼠，雌性，8~10 wk龄，体质量18~20 g（重庆医科大学实验动物中心）.
1.2方法
1.2.1聚合酶链反应(pcr)扩增目的基因将12株spn在c+y培养基中增菌至对数生长中后期，按试剂操作说明书分别提取基因组dna，扩增clpp的开放读码框架(591 bp). 上游引物：5′cgaattcatgattcctgtagttat3′，含ecori位点；下游引物：5′cgagctcttagttcaatgaattgttg3′，含saci位点，引物由上海生工生物技术公司合成. 使用la taq高保真dna聚合酶，以不同型spn基因组dna为模板进行扩增. pcr体系: ddh2o 13.7 μl，5×buffer(含mg2+) 6.0 μl，dntp(10 mmol/l) 2.4 μl，p1(5 pmol/l) 3 μl，p2(5 pmol/l) 3 μl，spn dna 1.5 μl，la taq 0.4 μl. 在pcr仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5 min后反应30个周期：94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min. 末轮后72℃延伸 5 min. 取5 μl反应产物置10 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定后，dna胶回收试剂盒回收pcr产物.
1.2.2ta克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个pcr产物克隆至pmd18t载体，转入dh5α感受态细胞，在amp+lb平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序.
1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用dnassist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与genbank数据库对已公布的tigr4 spn全基因组序列进行相似性分析.
1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具antigenic predicted antigenic peptides（<a href="http://bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn" target=_blank clpp蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.>http://bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn clpp蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.
1.2.5petclpp重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统pet32a(+)/clppe.coli bl21(de3)在终浓度1 mmol/l iptg，37℃，250 r/min条件下诱导目的重组蛋白clpp的表达. 收集的菌体超声波碎菌后，采用ninta柱纯化目的蛋白，以sdspage和biorad凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表达与提纯效果. 将透析除盐的纯化蛋白溶液经bradford法定量后备用.
1.2.6anticlpp抗血清的制备稀释后重组clpp蛋白溶液与等体积的cfa或ifa充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白. 初次免疫时小鼠接受含200 μl(含重组蛋白10 μg)的cfa与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受200 μl(含重组蛋白10 μg)的ifa与重组蛋白混合物. 小鼠经3次免疫后，分离小鼠血清，并用elisa法测其anticlpp抗体效价.
1.2.7western blot检测将12株spn在c+y培养基中增菌至对数生长中后期（a620 nm 0.5~0.6左右），各取2 ml菌液离心取沉淀. 沉淀用pbs洗3次，用1×上样buffer处理后，于100℃水浴5 min. 全菌裂解物经sdspage电泳分离后转膜. 以anticlpp多克隆抗体为一抗（1∶400)，羊抗鼠hrpigg为二抗（1∶5000），dab为显色底物，western blot检测菌体中clpp蛋白的表达，以金黄色葡萄球菌作为对照.
2结果
2.1目的基因pcr产物12株细菌的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见清晰的扩增条带，产量高，所有pcr产物的分子大小一致，都位于600 bp左右(图1).
2.2ta克隆载体的构建与鉴定将12个重组克隆质粒双酶切后，经10 g/l的琼脂糖凝胶电泳，于期望位置上出现目的条带(图2)，证明clpp开放读码框架正确克隆入pmd18t载体，同时菌落pcr结果也证明基因克隆正确.
2.3测序结果与序列比对不同株的clpp基因编码区大小与tigr4菌株中clpp基因一样，均为591 bp，起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码196个氨基酸，基因序列一致性超过99%. 由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为99.5%以上. 经生物学信息软件分析结果显示，serotype 4，5，6b 三菌株clpp氨基酸序列与tigr4菌株clpp氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，serotype 1 spn与tigr4菌株clpp氨基酸序列仅存在着两个氨基酸的差异，其余血清型与tigr4菌株clpp氨基酸序列完全一致.
2.4抗原表位分析结果12株spn clpp蛋白的抗原表位数目相同（分别含7个抗原表位）并且氨基酸组成及分布完全一致.
2.5融合蛋白及其anticlpp抗体效价转化菌经iptg诱导后，较未诱导菌有一条明显增粗的蛋白条带，mr约为42×103左右，与期望值相符合（clpp蛋白约为mr 21×103，再加上mr 21×103左右的硫氧还蛋白）. 蛋白溶液经镍离子柱亲和层析后透析，sdspage证明纯化产物为单一蛋白，纯度达90%. 该蛋白免疫小鼠后用elisa法测得的血清效价为1∶68 000（图3）.
2.6clpp蛋白的表达spn全菌裂解物经电泳分离后，与制备的anticlpp血清反应，12型spn全菌裂解物mr均在21×103的位置出现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现(图4). 提示不同血清型spn中均有clpp蛋白抗原的表达.
3讨论
蛋白疫苗是spn的第三代疫苗. 目前认为理想的spn蛋白质疫苗的标准应包括:能在细胞壁表达或者以分泌方式表达、在人体内抗原性高、能诱导杀菌的抗体和具有高度的保守性. 随着基因组学与蛋白组学的发展，spn毒力相关蛋白候选疫苗不断地被筛选出来. 但是一些蛋白由于等位基因的变异［5-7］，针对于该蛋白的抗体升高不能识别其等位基因变异的表达产物，从而不能诱导针对不同血清型菌株广泛的免疫保护. 因此，候选疫苗是否具有诱导高水平、能与不同种类的型或亚型菌株起交*反应的抗体的能力，是很多致力于spn疫苗的专家不断寻找高保守蛋白疫苗的原因［8-9］.
我们要评价clpp候选蛋白疫苗的价值就应考虑其在不同血清型spn的保守性，并考虑clpp是否在spn菌体中表达. 本研究选用分离自不同标本并且在中国比较常见的［10］12株不同血清型spn进行研究，结果发现，在12株菌中clpp基因相当保守，其抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致，无抗原位点的突变，而且12株spn菌体蛋白中都有clpp蛋白的表达. 我们的结果初步表明：clpp在不同血清型spn中高度保守，在不同型菌体中都有表达.
细胞壁表达的高保守性蛋白是首选的疫苗靶点. 目前研究较多的几个spn蛋白质疫苗如pspa［11］，pspc［6］和ply［12］等，pspa和pspc虽在细胞壁表达，但由于等位基因变异，保守性相对较差；ply虽具有较高的保守性，但在细胞内表达，其抗体难以透过细胞壁与之结合，疫苗保护效果难以得到保证. 而clpp在spn热休克后从细胞内向细胞壁易位［3］，同时具有高度的保守性，因此它是spn很好的疫苗靶点，将其单独使用或与其他的蛋白疫苗组合使用，可能会使spn蛋白疫苗的研究取得突破性进展，从而为我们自主开发广保护范围的spn疫苗提供理论基础.
另外我们也采用了blast方法分析了spn clpp与邻近种属细菌clpp基因序列的相似性，发现spn clpp与许多其它种属细菌的clpp基因序列具有高度的同源性，比如spn的clpp与唾液酸链球菌clpp的预测氨基酸序列相似程度为87%~88%，与无乳链球菌clpp的预测氨基酸序列相似程度为91%~92%. clpp可能在这些菌属中存在相同的抗原表位，并可能诱发交*反应，这应该引起注意. 总之，在大规模人类免疫接种前对这类高保守蛋白进行彻底的安全性调查，将是非常必要的.
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