作者：黄金 吉利娜 张永亮 陈妍 裴毅
【摘要】 目的: 通过分析不同病期血液中淋巴细胞cyclind1、p16、p27的表达情况，探索这些指标在癌症发生发展变化中的临床意义。方法: 回顾性分析86例经病理诊断的癌症患者的血液学cyclind1、p16、p27的表达情况，比较稳定和进展组间cyclind1、p16、p27表达的差异性（其中52例稳定、34例进展），计量资料以(x〖tx-〗±s)表示，采用两独立样本t检验，计数资料采用卡方检验，p <0．05差异有统计学意义；并采用logistic回归分析筛选单因素年龄、性别及cyclind1、p16、p27中能够预测疾病病情的因素。结果: 年龄和性别因素在稳定组和进展组之间无明显差异性（p > 0.05），外周血淋巴细胞cyclind1、p16的表达进展组均显著高于稳定组（p <0.05）；p27的表达在稳定组和进展组之间无明显差异性（p > 0.05）；logistic回归分析，cyclind1对病情的预测有统计学意义（p<0.05）。wwW.11665.COm结论: cyclind1、p16的高表达提示癌症患者病情可能进展，其中cyclind1的增高对病情的预测敏感性高，p27的变化对癌情检测没有明确的临床意义。
【关键词】 癌症患者;cyclind1;p16;p27;病情预测
恶性肿瘤的形成是多步骤、多基因改变的积累过程，涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，单一的一种指标已不能确切的判断肿瘤的发生发展，对多基因的综合研究势必能更准确的反映肿瘤的生长和机体的整体状况[1]。本研究试图从细胞周期的失控调节方面，寻找能较准确预测肿瘤病人病期及判断预后情况的指标。
1 材料与方法
1.1 临床资料:收集2008年~2009年间入住我科治疗的86例经病理诊断的癌症患者，其中52例为经标准抗肿瘤治疗4个周期以上缓解后一直稳定1年未见癌转移的患者，男25例,女27例，中位年龄60岁（41~76岁）；另34例为进展期的癌症患者，其中男23例，女11例，中位年龄62岁（30~82岁）。所有患者均排除影响外周血淋巴细胞水平的疾病（如炎症、过敏、自身免疫疾病等)。
1.2 分组:稳定组：经标准治疗至少4个周期的癌症患者，病情持续稳定1年未发生转移。按实体瘤疗效评定<肿块变化达cr、pr、sd者；和/或无肿块，肿瘤标志物持续阴性达1年以上者>。
进展组：初次发病；或出现新的转移灶；和/或有可观察肿块增大>25%，肿瘤标志物任何一项增高(+++)以上并持续3个月以上者。
1.3 主要试剂和仪器:鼠抗人cyclind1、p16、p27单克隆抗体(1：100)购自福州迈新生物技术开发有限公司，异硫氰酸荧光素(f1tc)羊抗鼠igg(1：400)购自北京华美生物技术开发有限公司，流式细胞仪为美国bd公司facs420型。
1.4 实验方法。
1.4.1 取样。稳定组在治疗4个周期后经影像学和实体瘤疗效评价达稳定时，抽血；进展组经影像学和实体瘤疗效评价为进展时，抽血。在清晨、空腹、静卧条件下,取外周血2ml,注入盛有0.01ml0.1%乙二胺四乙酸二钠抗凝剂的试管中混匀.
1.4.2 实验步骤。取抗凝外周血2ml，用国产淋巴细胞分离液分离人抗凝外周血中的淋巴细胞，用pbs洗涤，洗涤后用70％乙醇固定过夜。离心去除乙醇，用pbs洗涤，调节细胞浓度为1×106/ml。穿透，加入一抗(使用鼠抗人cyclind1、p16、p27单克隆抗体)、二抗(fttc-igg抗体)，加入1mlpbs缓冲液，并设同型阴性对照．样品放在0~4℃环境中．准备上机检测。l5mw氩离子激光．激光波长488nm。用cellguest软件自动取每个样品×104个细胞并分析结果，记录样品的荧光指数(fi值)。
1.5 统计方法。用spss13.0软件包进行统计学处理，实验数据计量资料以(x±s)表示，进行正态及方差齐性检验，结果采用两独立样本t检验，计数资料的比较采用卡方检验，p<0.05为差异有统计学意义。采用logistic回归分析筛选年龄、性别及cyclind1、p16、p27中与预测疾病病情相关的因素。
2 结果
2.1 稳定组和进展组年龄、性别差异的比较分析。分别采用两独立样本t检验及卡方检验对52例稳定及34例进展的癌症患者进行年龄、性别的比较，分析年龄、性别因素对癌症患者疾病的影响，见表1。
注：分组中，0为稳定组，1为进展组，p<0.05差异有统计学意义。
表2 不同分组性别的比较
注：p<0.05差异有统计学意义。
表1的结果显示：年龄、性别因素在稳定组和进展组之间差异无统计学意义（p>0.05）。
2.2 稳定组和进展组外周血淋巴细胞中cyclind1、p16、p27表达水平的比较分析观察稳定组和进展组外周血淋巴细胞中cyclind1、p16、p27的表达水平，采用独立样本t检验，分析两组中各指标差异有无统计学意义，见表3。
注：分组中，0为稳定组，1为进展组。“*”表示有统计学意义，p<0.05。
表3的结果示：外周血淋巴细胞cyclind1、p16的表达在稳定组和进展组之间均存在差异性（p<0.05），进展组显著高于稳定组；p27的表达在稳定组和进展组之间无明显差异性（p>0.05）。
2.3外周血淋巴细胞中cyclind1、p16、p27表达水平的相关性分析
采用pearson相关分析cyclind1、p16、p27各指标的相关性，见表4。
注：“*”表示相关系数有统计学意义，p=0.000<0.05。
表4的结果示：外周血淋巴细胞cyclind1、p16之间成正相关，相关系数为0.73（p<0.05），p16与p27、cyclind1与p27之间目前的数据尚不能认为两指标有相关性（p>0.05）。
2.4 疾病病情认知的多因素分析。对以上判断疾病病情有意义的单因素进一步做logistic回归分析，筛选最能预测疾病病情的因素，见表5
表5的结果示：cyclind1进入回归方程，cyclind1对疾病病情的判断有统计学意义（p<0.05），而p16对疾病病情的判断无统计学意义（p>0.05）。
3 讨论
随着对细胞周期调控认识的不断深入，出现了“癌症可能是一类细胞周期疾病（cellcycledisease）”的观点[2]。近来的研究已表明，细胞周期调节失控是肿瘤发生、发展中重要的分子事件[3]。
任何因素导致细胞周期中的正负调节因子：细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cki)失去平衡，出现cyclin过表达或cki失表达、失活均可能引起细胞增殖失控产生肿瘤。cyclind1是细胞周期蛋白中一种重要的正性调节因子，与cdks结合促进细胞从g1期进入s期，而p16、p27是ckis家族中重要的负性调节因子，主要阻抑细胞于g1期，防止细胞冲破g1→s限制点过度增值，阻止肿瘤形成[4]。
近年来，大量研究者从基础医学到临床各个角度进行研究，众多学者发现外周血循环肿瘤标志物及免疫系统相关抗原的分子生物学检测能够较好并较早的反映机体肿瘤组织的生物学行为[5~8]，鉴于对肿瘤浸润淋巴细胞的检测受到标本的限制，外周血淋巴细胞的易抽取、患者易接受及检测方便和可动态观察等优越性，本文从外周血淋巴细胞表达抗原的变化角度，探讨抗原的变化与肿瘤临床生物学进展的关系。
在人类的甲状腺癌、乳腺癌、食管癌以及直肠癌中均发现cyclind1基因扩增和蛋白过度表达，提示cyclind1基因和蛋白的表达异常与肿瘤的发生相关[9,10]。本研究显示52例稳定及34例进展期的癌症患者外周血淋巴细胞中，cyclind1蛋白进展组明显高于稳定组（p<0.05），提示cyclind1蛋白增高时，可能预示肿瘤患者的病情进展，肿瘤生长较快。
在多种肿瘤组织中，都可以见到p16蛋白失表达[11],但p16异常的发生率在不同组织起源的肿瘤中差异较大。有学者认为p16变异在胃癌中频发，也有学者认为并不常见，另有学者却认为p16在胃癌中的表达反而增高[12]。本研究显示52例稳定及34例进展期的癌症患者外周血淋巴细胞中，p16蛋白进展组明显高于稳定组（p<0.05），提示p16蛋白增高时，亦预示肿瘤患者病情进展，肿瘤将较快生长。 文献报道p27蛋白可以抑制细胞生长、并诱导凋亡[13]；p27蛋白表达水平在多种肿瘤中明显下降；p27表达水平是胃癌、大肠癌、直肠癌的独立预后指标。本研究结果检测了血液中淋巴细胞p27的表达情况，进展期和稳定期之间并无显著性差异（p>0.05），可能由于病例数较少，或是组织来源的差异性，本指标对癌情的检测目前没有明确的临床意义，还有待于进一步观察。
本文表2中对cyclind1、p16、p27三个指标的相关性进行分析，结果显示：外周血淋巴细胞p16、cyclind1之间成正相关，相关系数为0.73（p<0.05），p16与p27、cyclind1与p27之间目前的数据尚不能认为两指标有相关性（p>0.05），提示肿瘤细胞中cyclind1过表达时，p16也将升高，这可能与p16将竞争性结合cdk4/6，阻止肿瘤细胞的过增长，但表1结果，cyclind1、p16的过表达，均提示机体的病情可能恶化，并没有出现cyclind1、p16并行增高时机体处于稳定的状态，这可能与二者的升高程度或其对疾病的影响程度有进一步的关系。
为了探讨各因素反应疾病病情的具体作用和程度，本文对判断疾病病情有意义的单因素cyclind1、p16进一步做logistic回归分析，筛选对判断疾病病情作用较大的因素。结果显示：cyclind1对病情的预测有统计学意义，而p16对疾病病情的判断无统计学意义，即考察因素中，cyclind1指标反映疾病进展的情况优于对p16指标的考察，cyclind1增高时，伴或不伴p16的增高，均提示患者病情进展的可能性较大。
综上，癌症患者病情进展时cyclind1、p16会出现不同程度的增高，但cyclind1的增高最有参考价值，cyclind1增高提示近期肿瘤细胞分裂增殖较快，癌症患者预后不良的可能性大。
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