作者：邸春霞，陆庆明，郭文怡，王海昌，张荣庆，殷忠
【摘要】 目的：观察不同浓度吡格列酮对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（epcs）增殖、凋亡和功能的 影响 ，并探讨其可能的作用机制. 方法 ：正常sd大鼠24只，随机分为a组（对照组）和b,c,d组［吡格列酮组剂量依次为10，20，40 mg/（kg·d）］，灌胃处理10 d后断颈处死，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，经鉴定后证实为epcs. 每组细胞培养4 d后消化、计数并用完全培养液培养. 24 h后检测no生成量，3 d后检测凋亡情况，7 d后检测增殖能力. 结果：与a组相比，b,c,d组epcs增殖能力明显增高［b，c，d组a490 nm分别为（0.423±0.004）, （0.680±0.008）, （0.443±0.005） vs a组a490 nm （0.143±0.006）, p<0.01］；凋亡程度降低［b，c，d组分别为(32.8±0.8)%， (30.9±2.3)%，(33.0±3.9)% vs a组(40.1±1.1)%, p<0.01］；培养上清中no浓度显著提高［b，c，d组分别为（29.2±3.7）， （41.0±7.7）， （28.7±6.4） μmol/l vs a组（18.9±1.4）, p<0.05］；与c组相比，b组和d组促进epcs增殖能力弱（p<0.01），培养上清中no浓度相对低（p<0.05）. 结论：不同浓度吡格列酮均能提高epcs数量和功能；20 mg/（kg·d）吡格列酮对epcs的作用较强.
【关键词】 吡格列酮；内皮祖细胞；糖尿病
0引言
血管内皮在心血管疾病发病机制中起重要作用，多种心血管疾病都伴有内皮功能障碍. 内皮祖细胞(epcs)是血管内皮的前体细胞，在特定应激条件下可分泌促血管生长因子并参与内皮修复和新生血管形成（包括血管新生和血管发生）［1］. 研究 ［2-3］发现，糖尿病患者的epcs增殖能力减退，体外黏附、形成毛细血管的能力也降低. 吡格列酮是一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，对2型糖尿病有较好的降糖效果和耐受性. 研究［4］表明，吡格列酮可以促进epcs介导的新生血管形成，但具体作用机制不明. 我们拟探讨体外培养条件下，不同浓度吡格列酮预处理对正常大鼠的骨髓源性epcs增殖、凋亡及功能的变化，为改善内皮损伤提供实验依据.
1材料和方法
1．1材料雄性sd大鼠24只，体质量70～80 g（第四军医大学实验动物中心）；m199培养基（美国gibco公司）；胎牛血清（美国hyclon公司）；血管内皮生长因子（vegf，美国biovision公司）；碱性成纤维细胞生长因子（bfgf，英国peprotech公司）；乙酰化低密度脂蛋白（diiacldl，德国invitrogen公司）；胰岛素和荆豆凝集素i（fitcueai，美国sigma公司）；ac133和cd34（英国ebioscience公司）； flk1（美国chemicon公司）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品 科技 有限责任公司）；no检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；盐酸吡格列酮（成都宇洋高科技 发展 有限责任公司）.
1．2方法
1．2．1实验分组及吡格列酮干预将大鼠随机分为4组，每组6只，a组（对照组）给予9 ml/l注射用生理盐水，b，c，d组分别给予盐酸吡格列酮10，20，40 mg/（kg·d）. 灌胃喂养10 d.
1．2．2分离培养epcs颈椎脱臼法处死大鼠，剥去皮肤，取四肢置750 ml/l乙醇5 min；将骨两端软骨用无菌剪刀剪除，用m199培养液冲洗骨髓腔；将骨髓细胞悬液轻置于淋巴细胞分离液表面、离心并吸取乳白色单核细胞层，m199培养液洗涤后用含vegf，bfgf的完全培养液重悬、计数并接种到培养瓶中，4 h后将培养瓶翻面.
1．2．3epcs表型鉴定培养6 d的细胞用2.5 g/l胰酶和0.2 g/l乙二胺四乙酸消化并接种于盖玻片. 24 h后向细胞爬片孔内加入10 mg/l diiacldl 100 μl并置37℃孵育1 h，多聚甲醛室温固定10 min，pbs漂洗后加入10 mg/l fitcueai 100 μl，避光孵育1 h，pbs洗涤、晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察.
1．2．4no检测将培养4 d的细胞消化、计数后以1.5×104/孔接种于96孔板培养. 按no试剂盒说明书，24 h后于每孔吸上清100 μl，采用硝酸还原酶法特异性将各孔上清液中no3-还原为no2-，并测定no2-浓度，从而间接反映no含量.
1．2．5凋亡检测将培养4 d的细胞消化，不完全培养液(无血清)培养24 h后加入含血清的完全培养液培养. 3 d后再次消化贴壁细胞，以1000 r/min离心5 min后弃上清，行双标记流式细胞术检测.
1．2．6增殖能力检测分离epcs并以1.5×104/孔接种96孔板. 培养7 d后向每孔培养液中加入5 g/l mtt溶液20 μl，置孵育箱4 h后吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μl，微量振荡器充分振荡10 min，用酶联免疫检测仪测各孔a490 nm.
统计学处理：数据以x±s表示，采用spss 13.0统计软件对多组比较采用单因素方差 分析 ，多重均数差异显著性检验采用lsdt检验，p<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2．1细胞形态观察①显微镜下见培养7 d的细胞多呈梭形或多角形，且有集落样结构出现. ②培养7 d的细胞经diiacldl（红色荧光） 和fitcueaⅰ（绿色荧光）双染后，激光扫描共聚焦显微镜观察示双染阳性（桔黄色荧光）细胞为正在分化的epcs(图1).
a: diiacldl 阳性；b: fitcueaⅰ阳性；c: diiacldl和fitcueaⅰ双染.
图1激光扫描共聚焦显微镜检测细胞表面标志免疫荧光双染法 ×200
2．2不同浓度吡格列酮对epcs增殖能力的影响a～d各组a值依次为：（0.143±0.006），（0.423±0.004），（0.680±0.008），（0.443±0.005）. 与a组相比，b，c，d组对epcs增殖有明显的促进作用（p<0.01）；与c组相比，b，d组促进epcs增殖作用较弱（p<0.01）.
2．3不同浓度吡格列酮对epcs凋亡程度的 影响 a～d各组凋亡率分别为(40.1±1.1)%, (32.8±0.8)%, (30.9±2.3)%, (33.0±3.9)%. 与a组相比，b，c，d组各组epcs凋亡率均较低，差别有统计学意义（p<0.01）；但吡格列酮各处理组之间的抑凋亡作用对比差异无统计学意义.
2．4不同浓度吡格列酮对epcs分泌no的影响a～d各组no浓度依次为（18.9±1.4）, （29.2±3.7）, （41.0±7.7），（28.7±6.4） μmol/l. 与a组相比，b，c，d组各组中no浓度显著提高（p<0.05）；与c组相比，b，d组中epcs生成no的量较少（p<0.05）.
3讨论
循环epcs数量可作为预测血管功能和心血管病危险程度的指标，其数量减少提示血管内皮修复能力降低，心血管疾病发生率增高［5］. 故用药物增加epcs数量并改善其功能，促进心血管病患者血管内皮修复和血管新生，成为 治疗 心血管疾病的新策略. 我们的结果表明体内吡格列酮处理能促进epcs增殖，改善其功能，加强epcs对心血管的保护作用.
epcs表面表达γ型过氧化物酶体增殖物激活受体（pparγ）. pparγ在血管与心肌组织均有表达，参与调节氧化应激、炎症、平滑肌细胞迁移与增殖、动脉粥样硬化等多种病理生理过程，在促进细胞凋亡特别是抗肿瘤方面起重要作用. 吡格列酮是一种噻唑烷二酮类（tzds）胰岛素增敏剂，可通过激活pparγ发挥降血糖作用. 与促进肿瘤细胞凋亡不同，chen等［6］ 研究 发现吡格列酮可通过调节tnfa水平减少冠状动脉内皮细胞的凋亡，减轻内皮损伤；体外给予吡格列酮可以通过增加抗凋亡蛋白bcl2的活性和抑制caspase3的活性途径减少缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡，缩小梗死面积［7］. 我们的实验也表明不同浓度吡格列酮均可促进epcs增殖，抑制epcs凋亡，进一步验证了吡格列酮对心血管系统的保护性作用. 实验结果还表明不同浓度吡格列酮促增殖作用不同，以20 mg/（kg·d）吡格列酮的促epcs增殖作用最强. 其可能机制为pparγ激活后可以抑制核转录因子 kb(nfκb)的活化，而此因子活化可以促进一系列促动脉硬化基因的表达，并且抑制epcs的数量和功能.
我们还发现吡格列酮能够促进epcs分泌no. no分泌量是衡量内皮细胞功能的标志，内皮功能障碍通常表现为 no分泌减少. 临床研究表明，糖尿病患者血管内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶（enos）低表达，导致no释放选择性地减少［8］. no减少可导致血管舒张功能减退、促进糖尿病血管并发症的发生 发展 及急性冠脉综合征的发生. 本实验中，较低浓度吡格列酮可呈浓度依赖性促进epcs分泌no，考虑为吡格列酮激活epcs表面的pparγ后，通过3磷酸肌醇激酶（pi3k）蛋白激酶b（akt）enos信号转导途径促进epcs生成no［9］. 而no不仅可以舒张血管，而且可以促进epcs的动员、分化和归巢. 此外，实验结果表明高浓度吡格列酮对epcs功能的正性作用不及中浓度组明显，具体机制尚待进一步探讨. 本实验只是观察不同浓度吡格列酮对大鼠骨髓源性epcs数量和功能的影响. 但糖尿病患者 应用 吡格列酮后通过epcs所产生的对心血管系统的保护性作用尚需进一步探讨.
【 参考 文献 】
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