作者：丁钢，龙晓英，袁飞，陈莉，钟雪萍,叶美华，朱树强
【摘要】 目的 制备瑞格列奈片，并建立其质量标准。方法 以溶出度、硬度、外观为指标，通过正交试验l9(34)筛选出最优处方;采用高效液相法测定瑞格列奈的含量、含量均匀度和溶出度。结果 优选出的瑞格列奈片的处方组成为:微晶纤维素∶pvpk30∶ccna的质量比为74∶5∶20;含量测定方法学考察结果：瑞格列奈质量浓度在9.905～99.05 μg·ml-1范围内与峰面积呈良好线性关系，回收率为100.83%、rsd为0.98%(n=9)，最低检测限为2.0 ng，最低定量限为8.0 ng;含量均匀度为6.84;30 min累积溶出度为98.25%。结论 筛选的处方合理，制备工艺简单可行，制备的瑞格列奈片符合制剂质量要求。
【关键词】 瑞格列奈片;正交试验;hplc;含量测定;质量标准
abstract:objective to prepare repaglinide tablets and establish the quality standard. methods orthogonal array testing was conducted to optimize the formulation with the indices of dissolution rate，appearance and hardness. hplc method was established to measure content,content uniformity and dissolution rate. results the optimum formulation of repaglinide tablets was mcc∶pvp k30∶ccna=74∶5∶20,and a good linear relationship was obtained in the range of 9.905～99.05 μg·ml-1，r=1.0 000. the average recovery was 100.83%,with rsd 0.98%(n=9).the lod was 2.0 ng and the loq was 8.0 ng,content uniform was 6.84,and dissolution was 99.25%.conclusion the reasonable formulation was obtained and preparation was simple,and the prepared tablets met the requirements.
key words:repaglinide tablets;orthogonal array test; hplc;content determination; quality standard
瑞格列奈(repaglinide,rg)是由德国诺和诺德公司于1998年在美国率先上市的 治疗 ⅱ型糖尿病的一线口服降糖药[1]，可在患者体内模拟生理性胰岛素分泌，有效控制餐后血糖，具有吸收快、起效快、作用时间短、不增加患者体重、安全性高的特点。wWw.11665.COM瑞格列奈具有广阔的市场前景，据 文献 报道其用药频度占据降糖药中的第二位[2]，用药频率增速在常用口服降糖药中居首位[3]。由于瑞格列奈的专利保护刚刚到期，市场长期被进口的瑞格列奈片主导，国内仅有一家药厂在我国受理瑞格列奈专利前抢先仿制。目前国内还没有瑞格列奈剂型研究的文献报道。瑞格列奈在水中几乎不溶，药物体外溶出度差，导致其生物利用度低[4]。本文采用正交试验以溶出度为主要指标，筛选瑞格列奈片的最佳处方组成，同时由于瑞格列奈片的规格为0.5 mg·片-1，按照 中国 药典要求，以含量、含量均匀度、溶出度为指标，建立其质量标准。
1 仪器与试药
1.1 仪器
zp19旋转式压片机(上海天和制药机械有限公司)，zrs8g 智能溶出试验仪(天津大学无线电厂)，岛津lc20a 高效液相色谱仪(日本岛津有限公司)，岛津uv2450紫外分光光度计(日本岛津有限公司)，phs3c实验室ph计(上海鹏顺 科学 仪器有限公司)，十万分之一 电子 天平(德国赛多利bp211d电子天平)。
1.2 试药
瑞格列奈对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100753200501);瑞格列奈原料药(浙江海翔药业股份有限公司，批号：30032071，含量100.4%);孚来迪(江苏豪森医药药业股份有限公司，批号：081107);乳糖(德国美剂乐集团);交联聚维酮(pvpp,东北制药总厂);羧甲基淀粉钠(cmsna，浙江菱湖联合化工厂);交联羧甲基纤维素钠(ccna，德国jrs公司);羧甲基纤维素钠(cmcna,广州市医药公司);微晶纤维素(mcc,湖州展望药业有限公司);聚维酮k30(pvpk30,东北制药总厂);羟丙甲基纤维素60rt50(hpmc 60rt50,山东瑞泰化工厂);甲醇为色谱纯;磷酸二氢铵、醋酸铵、磷酸、盐酸等均为分析纯;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 片剂制备
将辅料(硬脂酸镁除外)，分别过100目筛，混匀，再与原料药等量递增混匀，加入适量的水制软材，过24目筛制粒，60 ℃干燥3 h，再加入质量分数0.5%的硬脂酸镁，混匀、整粒，采用直径为6.5 mm的平冲压片，片重100 mg。每片含瑞格列奈0.5 mg。
广东药学院学报 第25卷 第6期 丁钢,等.瑞格列奈片的制备和质量标准研究2.2 处方设计[5]
在预试验的基础上，选择填充剂(a)、黏合剂(b)、崩解剂(c)为考察因素，采用l9(34)正交表设计试验，以硬度(x1)、溶出度(x2)及外观(x3)为考察指标进行综合评分，评分标准：5分(硬度2.9～3.2 kg，溶出度﹥90%，外观比较光洁)，4分(硬度2.6～2.9 kg或3.2～3.5 kg，溶出度75%～90%，外观光洁)，3分(硬度2.3～2.6 kg或3.5～3.8 kg，溶出度60%～75%，外观平整)，2分(硬度2.0～2.3 kg或3.8～4.1 kg，溶出度45%～60%，外观稍显粗糙)，1分(硬度1.7～2.0 kg或4.1～4.4 kg，溶出度30%～45%，外观比较粗糙)，0分(硬度<1.7或>4.4 kg，溶出度<30%，外观非常粗糙);综合各因素权重得到综合分y=0.2x1+0.6x2+0.2x3。
正交试验的因素和水平见表1，试验结果和分析见表2、表3。表1 因素水平表表2 正交试验方案及结果表3 方差分析表由表2的极差分析结果可见，各因素的影响大小顺序为b>a>c;由表3的方差分析结果可见，a、b、c 3个因素对实验结果均无显著影响;确定最佳处方组合为a2b2c3，即:74 mg的mcc,5 mg pvpk30,20 mg的ccna。
验证试验：按正交试验筛选出的最佳处方压制片剂，经溶出度试验，测得3个批号的瑞格列奈片的30 min时的累积溶出率为(98.25±1.78)%，确定该处方为瑞格列奈片的处方。
2.3 含量测定方法学的建立
2.3.1 溶液的制备
2.3.1.1 对照品溶液 精密称取瑞格列奈对照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。取对照品储备液2.5 ml，置10 ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.3.1.2 供试品溶液 取瑞格列奈片20片，精密称定，研细，精密称取适量(相当于瑞格列奈2.5 mg)置50 ml容量瓶中，加流动相至刻度，超声15 min溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液即得。
2.3.2 色谱条件 色谱柱：dikma c18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇磷酸盐缓冲液 (2.0 g磷酸二氢铵溶于1 000 ml水中，加磷酸调节ph至2.5)(体积比70∶30);流速：1.0 ml·min-1;检测波长：243 nm;柱温：40 ℃;进样体积：20 μl。瑞格列奈色谱峰的理论塔板数为36 393，对照品及样品的色谱图见图1。
2.3.3 标准曲线及线性范围 精密吸取“2.3.1.1”项中的对照品储备液0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(a)为纵坐标，以质量浓度 (ρ)为横坐标进行线性回归，得回归方程：a=0.1828ρ+0.0544，r=1.000 0，表明瑞格列奈质量浓度在9.905～99.05 μg·ml-1范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.3.4 精密度试验 取对照品溶液(50 μg·ml-1)，连续进样6次，记录峰面积。结果峰面积的rsd值为0.30%，表明仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验 取“2.3.1.2”项的供试品溶液(50 μg·ml-1)分别于日内测定5次和连续5 d测定，结果日内rsd值为0.28%,日间rsd值为0.51%，表明供试品溶液稳定。
2.3.6 回收率试验 分别精密称取瑞格列奈原料药40.0、50.0、60.0 mg及按处方配比量相当于瑞格列奈50 mg相应的辅料，置100 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，超声15 min溶解，精密移取上清液5 ml至50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别得质量浓度为40.0、50.0、60.0 μg·ml-1的供试品溶液，每个浓度分别平行做3份;另取瑞格列奈对照品同法配制对照品溶液(50 μg·ml-1)。按“2.3.2”项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积 计算 回收率，结果见表4。表4 瑞格列奈的回收率试验结果
2.3.7 最低检测限与定量限 取空白基线一段，计算其噪音的平均峰高，再将瑞格列奈对照品溶液用流动相稀释至适当浓度，进样20 μl，使其峰高为噪音的3倍，得最低检测限为2.00 ng;使其峰高为噪音的10倍，得定量限为8.00 ng。
2.4 样品含量测定
分别取3个不同批号的瑞格列奈各20片，按“2.3.1.2”项方法配制供试品溶液;取“2.3.1.1”项的对照品溶液;分别测定，按外标法以峰面积分别计算样品中的瑞格列奈的含量，结果测定3个批号样品含量分别为99.32%、101.05%和98.78%，符合规定。
2.5 样品的含量均匀度测定
取瑞格列奈片10片，分别置10 ml容量瓶中，加流动相至刻度，超声15 min，使瑞格列奈溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液测定含量。按外标法以峰面积分别计算样品中的瑞格列奈的含量，结果含量均匀度a+1.8s=6.84<15，符合规定。
2.6 溶出度测定
取瑞格列奈片6片，照溶出度测定法( 中国 药典2005年版二部附录ⅹ c 第三法)，以0.1 mol·l-1盐酸溶液100 ml为溶出介质，转速50 r·min-1，依法操作，30 min时取样，滤过得供试品液;取瑞格列奈对照品适量，加0.1 mol·l-1盐酸溶液配制对照品溶液(5 μg·ml-1);按照“2.3.2”色谱条件测定，计算瑞格列奈片30 min的溶出度。同时，进行自制瑞格列奈片与上市产品(孚来迪)分别在2、5、8、11、15、30 min时取样，测定含量，进行溶出曲线的对比，结果见图2。自制瑞格列奈片与上市产品有相似的溶出曲线，并且自制瑞格列奈片对应时间点的累积溶出量高于上市品。
3 讨论
3.1 辅料筛选
瑞格列奈的溶解度低，生物利用度差，因此处方设计时主要考虑如何提高其溶出度。本文中，交联羧甲基纤维素纳作为崩解剂可使药片瞬时崩解，从而提高溶出速度;mcc具有较大的比表面积，吸附性好，遇水可迅速崩解形成均匀的黏性混悬液，增加溶出速率;黏合剂pvpk30的水溶液，可使疏水性颗粒表面亲水性增加，加快崩解和溶出[6]。从“2.6”项的溶出曲线(图2)可以看出，自制品10 min时的累积溶出百分率已超过90%，证明正交试验筛选得到的处方是合理的。
3.2 流动相的选择
我国新药转正标准[7]采用ph 4.0醋酸铵缓冲液(取醋酸铵3.85 g，加水1000 ml使溶解，用冰醋酸调ph值至4.0)甲醇(体积比20∶80)为流动相，但在考察此流动相ph值变动的耐用性时，ph值变动0.2时的rsd值为3.46%，不符合规定。姚静等[8]采用ph 6.5的磷酸氢二钾缓冲液为流动相，经重复试验表明色谱峰有拖尾现象(拖尾因子1.46)。本文参照美国药典[9]，以ph 2.5的磷酸二氢铵缓冲液(取磷酸二氢铵2.0 g，加水1000 ml使溶解，用磷酸调ph值至2.5)甲醇(体积比30∶70)为流动相，其耐用性相对国家新药转正标准有较大提高(流动相变动0.2个ph，耐用性rsd为0.99%，符合规定)，且色谱峰对称(拖尾因子1.09)。
由上可见流动相缓冲盐的ph值对测定结果有较大影响。原因可能是瑞格列奈为弱酸性化合物，其pka1为4.16，pka2为6.01[10]。流动相的缓冲盐的ph值在ph2.5时，瑞格列奈以h2r+形式存在;在ph4.0时，以h2r+和hr± 2种形式存在;在ph值6.5时，以hr±和r-2种形式存在[10]。而以2种形式存在时，由于极性不同，保留时间不同，随着流动相的洗脱，2种存在形式在色谱柱中被分离，原来的解离平衡被打破，2种存在形式在各自谱带区里再建立新的解离平衡，导致峰拖尾[11]，造成测定结果重现性差。依据上述分析，本文采用ph 2.5的缓冲盐为流动相要优于 文献 [7.8]中所用的ph 4.0和ph 6.5缓冲盐。
3.3 含量测定溶剂选择
试验过程中曾采用国家新药转正标准所用的0.1 mol·l-1盐酸为溶剂溶解提取辅料中的药物，通过回收率试验发现0.1 mol·l-1盐酸难以将药物提取完全(回收率为91.3%)，后改用本文色谱条件中的流动相为溶剂，回收率可达到100.83%(n=9)，原因可能是因为流动相中含70%的甲醇，对溶解度小的瑞格列奈有比较好的溶解度的缘故。
【 参考 文献】
[1] 徐晖，李中东，王宏图. 餐时血糖调节剂-瑞格列奈[j].
