山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究的论文_西医学论文

作者：简文，樊爱琳，尹文，戚好文，柏长青

【摘要】 目的：探讨山莨菪碱（6542）对家兔创伤性急性肺损伤（ali）治疗作用的分子生物学机制. 方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（cg），肺损伤组（ig）和治疗组（eg），每组24只. 各组动物分别于肺损伤模型建立后1, 2, 3, 4 h各放血处死6只，留取支气管肺泡灌洗液（balf），分离肺泡巨噬细胞（pam），用凝胶电泳迁移率改变分析法（emsa）和rtpcr法检测pam中nfκb的活性变化及tnfα mrna的表达水平，用elisa法检测balf上清中tnfα和il8的含量. 结果：ig nfκb活性、tnfα mrna表达及tnfα, il8含量于模型建立后1~4 h内均明显高于cg（p<0.01）；eg经山莨菪碱治疗后上述指标与ig相比均有明显下降（p<0.01, p<0.05）. 结论：山莨菪碱对ali有治疗作用，此作用与其对nfκb活性及tnfα mrna, tnfα, il8表达抑制有关.

【关键词】 山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子κb；细胞因子

0引言

tnfα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acute lung injury, ali）的发生、发展中起重要作用［1］. nfκb是一种基因转录调节蛋白，通过调控tnfα和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］. 山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］. 此类药物在ail的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］. 我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ali时nfκb活化、tnfα mrna表达及balf中tnfα, il8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ali的可能机制.

1材料和方法

1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，由本校动物实验中心提供. lipopolysaccharide（o111:b4，lps，sigma）；nepertm试剂盒（pierce）；gel shift assay 试剂盒（promega）；γ32p atp（北京亚辉生物医学工程公司）；trizol reagent（gibco）；rna pcr试剂盒（大连takara）；elisa试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.

1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（control group，cg）、创伤性急性肺损伤（injury group，ig）和山莨菪碱治疗（experimental group，eg）3组，每组24只. ig, eg动物lps注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，cg不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素. eg动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2 mg/kg iv，随后以1 mg (kg/h)维持，cg和ig分别予以等量生理盐水，剂量与方法同eg. 各组分别于模型建立后1, 2, 3, 4 h由颈动脉插管放血处死6只动物. 立即行气管插管，用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage fluid，balf），5 ml/次，共10 ml，回收率70％左右. 将balf 1000 r/min离心10 min，沉淀用pbs液洗涤后用rpmi 1640培养液悬浮，置于25 ml培养瓶中，37℃，50 ml/l co2孵箱中培养1 h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度>95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.

1.2.1nfκb活性的检测用nepertm nuclear and cytoplasmic extraction reagents提取pam核蛋白，-70℃保存，bradford法测定蛋白浓度；用γ32p atp标记nfκb寡核苷酸探针(由gel shift assay 试剂盒提供)（5′agt tga ggg gac ttt ccc agg c3′,3′tca act ccc ctg aaa ggg tcc g5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（emsa）测定nfκb的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示nfκb的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验.

1.2.2tnfα mrna表达用trizol reagent试剂盒提取pam总rna，采用rtpcr法检测各时间点pam中tnfα mrna水平，参照文献方法设计特异引物：tnfα1：5′gct cac gga caa cca gct3′，tnfα2: 5′tcc caa agt aga cct gcc c3′，扩增产物332 bp，选用βactin作内参对照，与tnfα cdna一同扩增. 扩增产物行20 g/l琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以tnfα和βactin扩增产物（177 bp）的光密度比值来反应各组样品tnfα mrna的表达水平.

1.2.3balf中tnfα和il8含量的检测采用本校免疫学教研室的elisa kit进行检测，具体操作按说明书进行.

统计学处理：各组实验数据以x±s表示，方差分析比较3组动物各采样点有关指标的差异. 采用spss12.0版本统计软件包进行统计学处理，p<0.05为差异显著.

2结果

ig动物在肺损伤模型建立后均逐渐出现呼吸急促、躁动、紫绀等症状，呼吸频率从30~55次/min升至90~120次/min. eg动物上述症状明显轻于ig，其呼吸频率维持在80次/min以下，cg动物较安静，未出现上述症状，呼吸频率基本稳定在30~50次/min.

2.1兔pam中nfκb的活性cg动物nfκb活性在实验期间稳定在0.2以内. ig于模型建立后1～4 h内nfκb活性均明显高于cg（p<0.01），在2 h达到高峰，是同期cg的8倍. eg经山莨菪碱治疗后，nfκb活性虽然高于cg组，但明显低于ig（p<0.01），其中2 h降幅最大，达30.2％（图1）.

图1兔pam中nfκb的活性变化

2.2兔pam中tnfα mrna的表达ig在模型建立后1 h tnfα mrna的表达即开始上升，但峰值时间较nfκb滞后1 h，是同期cg的5倍，4 h tnfα mrna的表达较前有所下降，但仍明显高于cg（p<0.01）. eg经山莨菪碱治疗后各时间点tnfα mrna的表达较ig均有明显下降（p<0.01，p<0.05），最大降幅出现在2 h，达34.5%（图2）.

图2兔pam中tnfα mrna的表达

2.3兔balf中tnfα和il8的含量ig在模型建立1 h后balf中tnfα和il8含量即开始上升，3~4 h达到高峰，明显高于cg（p<0.01），与同期pam中tnfα mrna表达水平的变化相一致. eg经山莨菪碱治疗后各时间点balf中tnfα, il8含量较ig相比均有明显下降（p<0.01，p<0.05），最大降幅分别出现在3, 4 h，为30.7%, 35.7%（表1）. 表1兔balf中tnfα及il8的含量

3讨论

机体受到创伤、感染、休克等多种原因刺激后，可引起全身炎症反应综合征（systemic inflammation response syndrome, sirs）导致ali和ards，创伤和感染是两个重要因素，其发病机制复杂，涉及众多炎症介质及细胞因子［5-6］. nfκb是参与炎症反应的重要信号转导分子，通常与抑制蛋白iκb结合成无活性形式存在于胞质中，当细胞受感染、氧化剂等刺激后，iκb被水解，使nfκb的核定位序列暴露，与多种炎症介质（tnf, il1, il6, il8等）基因启动子或增强子中存在的κb序列结合，启动和调节其基因转录，与ali关系密切［7］. 我们发现：肺损伤模型组动物在撞击及注射lps后1～4 h内nfκb活性明显高于对照组（p<0.01），高峰出现在模型建立后2 h. pam中tnfα mrna的表达水平在模型建立后1～4 h内较对照组亦有显著升高（p<0.01），其高峰出现在3 h. 同时，balf中tnfα, il8的含量与对照组相比也有明显升高（p<0.01）. nfκb活性和tnfα mrna表达峰值水平的先后顺序性提示：创伤及lps引起pam中tnfα释放增加的机制可能是创伤及lps的刺激可活化pam中的nfκb，后者可上调tnfα的基因转录和蛋白合成，从而激发逐级放大的瀑布样链锁反应.

山莨菪碱是从植物中提取的一种生物碱，临床广泛用于治疗感染性休克、平滑肌痉挛、微循环障碍及各种神经痛等疾病［3］. 近年来用于防治ali，显示出良好的效果，但具体作用机制不明［4,8］. 本实验结果显示：对创伤性ali家兔给予山莨菪碱治疗可有效缓解家兔呼吸困难、紫绀等症状，显著降低 pam中tnfα mrna的表达及balf中tnfα和il8的含量（与损伤组比较，p<0.01，p<0.05），其最大降幅出现在2～3 h，并且可明显抑制pam中nfκb的活化（p<0.01，p<0.05），其最大降幅出现在2 h，较tnfα的最大抑制时间提前. 以上结果提示：山莨菪碱对tnfα及其下游细胞因子的抑制作用可能是通过nfκb实现的，nfκb可能是山莨菪碱体内作用的靶因子之一.

山莨菪碱通过对pam中nfκb活化的抑制，下调了tnfα基因的转录及蛋白的合成，从而减少了balf中tnfα及后续细胞因子il8的释放，从源头阻遏了炎性细胞因子的瀑布样链锁反应，对ali的发生与发展具有抑制作用. 至于山莨菪碱是通过什么途径来抑制nfκb的活化以及具体机制如何，尚待进一步研究 .

【参考文献】
［1］ leaver sk, evanstw. acute respiratory distress syndrome［j］. bmj,2007,335(7616):389-394.

［2］ miskolci v, rollins j, vu hy, et al. nfkappa b is persistently activated in continuously stimulated human neutrophils［j］.mol med, 2007,13(34):134-142.

［3］ “莨菪类药物在救治休克中的应用 ”高层专家论坛纪要［j］.中华急诊医学杂志,2005, 14(2):99.

［4］杨国栋,姚新民.莨菪类药治疗急性肺损伤的探索和药理学基础［j］.

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