罗格列酮上调高脂饮食老年大鼠骨骼肌glut4和pkb的表达
【关键词】 老年;胰岛素抵抗;葡萄糖转运蛋白4;蛋白激酶b;罗格列酮
【摘要】 目的 观察高脂饮食对老年大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(glut4)和蛋白激酶b(pkb)的表达变化及罗格列酮的干预效果。方法 老年大鼠随机分为对照组、高脂组(hf)、高脂+罗格列酮干预组(rsg),每组20只。应用清醒状态下正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术的葡萄糖输注率评价胰岛素抵抗，用荧光定量pcr法和western印迹技术检测骨骼肌glut4和pkb的表达。结果 高脂组骨骼肌长链脂酰辅酶a(lcacoa)升高而葡萄糖输注率明显下降(p<0.01)，骨骼肌glut4和pkb的表达明显降低(p<0.05,p<0.01)，罗格列酮干预组显著缓解高脂组上述变化(p<0.05,p<0.01)。结论 罗格列酮上调高脂饮食老年大鼠骨骼肌glut4和pkb的表达，是改善老年胰岛素抵抗的机制之一。
【关键词】 老年;胰岛素抵抗;葡萄糖转运蛋白4;蛋白激酶b;罗格列酮
【abstract】 objective to observe the expressions of glucose transporter 4 (glpt4) and protein kinase b (pkb) in highfatfed aged rats and the intervention effect of rosiglitazone. methods wistar rats were divided into control, highfat diet (hf) and highfat diet plus rosiglitazone maleate tablets (rsg) groups, 20 rats in each group. insulin sensitivity was evaluated by conscious hyperinsulinemiceuglycemic clamp techniques, the expressions of glut4 mrna and pkb mrna and protein were analyzed by real time pcr and western blot. results skeletal musclelongchain fatty acyl coenzyme a (lcacoa) was significantly higher and glucose infusion rate was significantly lower in control group than those in hf group. the expressions of glut4 and pkb were decreased in hf group, rsg group reserves were above of all the changes. conclusions the increased expressions of glut4 and pkb play a pivotal role in insulinsensitizing effect of rosiglitazone treatment, it maybe the one of the mechanism of improving insulin resistance.
【key words】 aging; insulin resistance; glucose transporter 4(glpt4); protein kinase b (pkb); rosiglitazone
研究发现2型糖尿病患者脂肪酸代谢异常引起的异位脂肪沉积与胰岛素抵抗(insulin resistance，ir)密切相关〔1〕。WWW.11665.COm胰岛素刺激骨骼肌摄取利用葡萄糖是通过一系列信号传导过程完成的，葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，glut4)和蛋白激酶b(protein kinase b，pkb)是胰岛素信号转导通路中的关键蛋白，其功能改变参与ir的发生。噻唑烷二酮类药物可以改善ir〔2〕，但机制不十分明确。本研究旨在观察高脂饮食和罗格列酮(rsg)干预对老年大鼠骨骼肌内脂质水平和glut4、pkb表达的影响，探索随年龄增长ir发生增加的可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级健康雄性22～24月龄wistar 大鼠60只，体重500～550 g，合格证编号：604095，购于河北医科大学实验动物中心。自由饮水，室温20℃～24℃，相对湿度40%～70%，每日维持12 h光照，昼夜循环。
1.2 药物和试剂
rsg(葛兰素史克公司，批号：05060018)。引物序列用danman软件设计(上海生物工程公司合成)：glut4引物上游序列：5′cccacaaggcaccctcacta3′，下游序列：5′tgccacccacagagaagatg3′，扩增片段长度62 bp。pkb引物上游序列：5′tctacggtgcggagattgtg3′，下游序列：5′cccggtacaccacgttcttc3′，扩增片段长度66 bp。western印迹分析：①一抗：glut4(45 ku)和pkb(60 ku)多克隆抗体，内参照甘油醛3磷酸脱氢酶(gapdh，35 ku)，单克隆抗体(santa cruze公司);②二抗：辣根过氧化物酶(hrp)标记的igg(北京中杉金桥生物公司)。
1.3 方法
1.3.1 动物分组和模型的建立
适应性喂养2 w，老年大鼠随机分为3组：对照组、高脂组(hf)、高脂+罗格列酮干预组(hf+rsg)，每组20只。对照组给予基础饲料，热量组成：碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%，总热量为348 kcal/100 g;hf组给予高脂饲料，热量组成：碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质20.1%，总热量为501 kcal/100 g;给予对照组和hf组大鼠每日等热量投喂饲料，所有饲料均由河北医科大学实验动物中心配制。大鼠喂养4 w后，钳夹实验评价hf组和hf+rsg组ir状态已形成。hf组和hf+rsg组除继续给予高脂饲料外，分别每日给予生理盐水及rsg 3 mg/kg灌胃，对照组喂养条件同前，继续喂养4 w。
1.3.2 清醒状态下正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术评价ir 参见文献〔3〕。
1.3.3 骨骼肌长链酯酰辅酶a(lcacoa)含量检测
参考antinozzi等〔4〕方法进行。取50 mg肌肉组织在10%三氯乙酸中匀浆，10 000 r/min离心10 min，弃上清，分别用1 ml的乙醚和水充分洗涤沉淀物2次，每次离心10 min。加入250 μl 的10 mmol/l二硫苏糖醇，涡旋后加入1 mol/l koh 调整ph升至 11.5，55℃ 孵育10 min。加入500 mmol/l kh2po4缓冲样品，用1 mol/l hcl调整ph至7.0，13 000 r/min离心10 min，弃上清。取250 μl下层液体加入750 μl缓冲液，混匀(缓冲液成分组成：2 ml 500 mmol/l ph7.0 kh2po4，26 μl 100 mmol/l α酮戊二酸，6～7 mg nad+，18 ml h2o，37℃孵育)。在每个试管中加入7 μl α酮戊二酸脱氢酶，用移液管吸打混匀，在10 min和20 min分别在荧光分光光度计(激发波长360 nm，发射波长460 nm)读取读数，确保反应完全。测出荧光值后，在标准曲线上计算lcacoa的浓度，以nmol/g组织表示。
1.3.4 骨骼肌glut4 mrna及pkb mrna检测
常规方法提取骨骼肌rna和反转录。实时定量pcr体系(50 μl)：实时荧光定量试剂(5×sybr绿染)10 μl，2 u/μl taq酶1.5 μl，25 mmol/l dntp 0.5 μl，10 pmol/μl上、下游引物各1 μl，cdna模板5 μl，双蒸水31 μl。反应条件：93℃预反应3 min;93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，40个循环，于每个循环延伸反应最后时刻收集荧光信号。
1.3.5 western印迹分析
1 ml裂解液〔100 mmol/l trishcl,ph8.0,1 mmol/l乙二醇乙二醚二胺四乙酸(egta),1 mmol/l乙二胺四乙酸(edta)，1 mmol/l苯甲基磺酰氯(pmsf)，1 mg/l亮抑酶肽,1 mg/l抑肽酶,50 mg/l胰蛋白酶〕加入150 mg组织，匀浆后分离上清，用考马斯亮蓝试剂盒进行蛋白定量。取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sdspage)电泳，10%分离胶，湿法电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别加入glut4和pkb多克隆抗体，4℃过夜，充分洗膜后加入hrp标记的二抗室温孵育2 h，二氢基联苯胺(dab)显色。重复上述步骤进行内参照gapdh (一抗1∶5 000稀释，二抗1∶3 000稀释)的结合。目的蛋白表达量以其特异性结合条带与gapdh结合条带的光密度比值表示。
1.4 统计学分析
用spss11.5软件进行统计分析，数据用x±s表示，组间差异用单因素方差分析(oneway anova)，有显著差异者用q检验，不同指标间采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 一般项目
第8周末，各组大鼠体重无差异。hf组血游离脂肪酸和肌肉内lcacoa显著高于对照组(p<0.01)，rsg干预后明显下降(p<0.01)。见表1。表1 各组大鼠第8周一般资料的比较
2.2 骨骼肌组织glut4、pkb表达结果
与对照组相比，hf组glut4、pkb mrna和蛋白表达明显降低(p<0.05或p<0.01)，hf+rsg组glut4、pkb mrna和蛋白表达与hf组相比明显升高，差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。见表2，图1，图2。图1 各组骨骼肌glut4、pkb mrna的表达表2 各组大鼠骨骼肌glut4，pkb mrna和蛋白表达水平
2.3 高胰岛素
正葡萄糖钳夹实验结果 第4周，hf组和hf+rsg组葡萄糖输注率〔(18.83±2.18)，(18.45±1.96) mg·kg-1·min-1〕明显低于对照组〔(23.8±2.79)mg·kg-1·min-1〕(p<0.01)，hf组与hf+rsg组无差异。8 w后，葡萄糖输注率降低更明显(p<0.01)，hf+rsg组葡萄糖输注率与高脂组比较明显升高(p<0.01)。见表1。图2 各组大鼠骨骼肌glut4和pkb蛋白表达
2.4 相关性分析
经相关分析表明，pkb mrna的表达与葡萄糖输注率呈明显正相关(r=0.741 1,p<0.01)，glut4 mrna的表达与葡萄糖输注率也呈明显正相关，与骨骼肌内lcacoa明显负相关(r=0.627 3，-0.613 6,p<0.01)。
3 讨 论
目前，脂毒性学说在糖尿病发生发展过程中的作用越来越受到人们的重视。增龄使代谢紊乱发生明显增多，研究表明老年时期大鼠脂肪酸氧化能力降低，促使肌内三酰甘油含量随增龄而增加;而且，肌内三酰甘油的含量与胰岛素敏感性负相关〔1〕。lcacoa是细胞内长链脂肪酸的活性形式，与三酰甘油相比，它能更好的作为研究脂代谢的指标是因为肌肉组织中的脂肪污染对其测定结果的影响微乎其微。本文结果发现高脂喂养老年大鼠明显升高，同时，清醒状态下高胰岛素正葡萄糖钳夹实验中的葡萄糖输注率降低，说明骨骼肌内脂质堆积可能参与了饮食诱导的老年ir的发生。
实时定量pcr和western印迹实验结果表明，与对照组相比，hf组的glut4和pkb表达均有明显下降。而在hf+rsg组两者的表达均有明显回升，与hf组差异明显。血中葡萄糖60%～70%在骨骼肌代谢，胰岛素刺激组织摄取和利用葡萄糖是通过胰岛素受体胰岛素受体底物1磷脂酰肌醇3激酶pkb等一系列信号转导过程完成的，最终使glut4转移到细胞膜，大量glut4的膜转移可加速葡萄糖摄入到细胞内。胰岛素信号转导通路中任一环节的异常都可能最终阻碍骨骼肌转运葡萄糖，从而引起ir。骨骼肌内脂质代谢产物与胰岛素信号转导有关，可能导致ir的发生。神经酰胺是肌内脂肪酸的代谢产物之一，在生理状态下用饱和脂肪酸作用于人肌肉成纤维细胞瘤(c2c12)骨骼肌细胞，可见pkb活性被抑制，而用神经酰胺抑制剂或增加其降解均可阻止这一效应的发生，说明脂质诱导ir机制之一可能是使神经酰胺生成增加，降低pkb磷酸化〔5〕。本研究发现老年大鼠骨骼肌pkb表达的量虽然与肌内lcacoa无明显相关性，但是否脂质代谢产物神经酰胺介导了pkb的表达异常需要进一步研究。
glut4是骨骼肌细胞膜上的一种转运蛋白，直接参与细胞对葡萄糖的摄取和转运，这一步骤是骨骼肌细胞利用葡萄糖的主要限速步骤，高脂喂养老年大鼠骨骼肌glut4 mrna和蛋白表达下降，表明glut4 mrna表达量与葡萄糖输注率正相关，和骨骼肌内lcacoa明显负相关。而且，细胞内lcacoa增多可转化成甘油二酯，使胰岛素刺激的pi3k激酶活性降低，因而glut4的生成及活性降低以致葡萄糖摄取减少〔6〕。lcacoa和ir发生的机制还有待进一步探讨。
过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)属于核受体超家族的新成员，研究发现骨骼肌pparγ可能参与肌肉组织的脂肪酸代谢紊乱与ir〔2〕。armoni等〔7〕利用pparγ1和2亚型分别与glut4启动子的共转染研究表明，pparγ1和2都存在非配体依赖性的对glut4启动子的抑制作用，内源性配体(长链脂肪酸及其衍生物)可能通过此机制阻止胰岛素作用，促进ir;外源性激活物质(格列酮类)可解除pparγ对glut4启动子的抑制作用，从而改善胰岛素敏感性。本研究也发现给予rsg干预后pkb、glut4 mrna和蛋白表达增加，骨骼肌内脂质也明显下降，为探讨格列酮类改善老年ir提供一个新线索。
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