作者：张菲斐，韩战营，邱春光，杨海波，黄振文，陈庆华，李凌，赵洛沙
【摘要】 目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（epc）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点. 方法 ：密度梯度离心法获得单个核细胞，用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中. 细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，直到晚期克隆出现. 同期培养人脐静脉内皮细胞（huvec）进行比较. 流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白. 体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能，胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能. 结果： epc在培养21~28 d出现，表现出典型的内皮细胞“铺路石”外貌. 与huvec相比，epc表达高水平的cd36和kdr（epc vs huvec, p<0.01），但表达cd146，结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异. 体外培养100 d，epc和huvec分别传代46次和25次，只有epc能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构. 结论：人外周血来源的epc虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点，但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征.
【关键词】 血管生成；内皮细胞；祖细胞；生物学性状
0引言
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, epcs）原始储存部位在骨髓，受缺血信号刺激后向外周血释放，募集到缺血部位参与血管新生. 但另有 研究 却发现， epcs在肿瘤血管新生、受损血管内皮修复、或成年动物体内血管再生方面，所起作用很小或几乎不起作用［1-3］. 我们研究首先确认外周血循环中是否存在有真正的epcs，然后将其与成熟内皮细胞进行完整生物学性状对比 分析 .
1材料和方法
1.1材料histopaque，1.077,fitc标记的植物凝集素（ulex europaeus agglutinin1, uea1）、纤连蛋白（fibronectin）、fitc标记的抗vegf2受体（kdr）、i型胶原均为sigma公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（egm2 mv single quots）和i型胶原酶为becton dickinson公司产品；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白（diiacldl）购自abd serotec公司；vwf一抗和fitc标记二抗均购自dako公司；pecd34， fitccd14，fitccd146，均为bd公司产品. 健康志愿者11（男9，女2）例，年龄46.5±13.1岁，肘静脉取血每例50 ml，肝素（20 ku/l）抗凝. hanks 1∶1稀释血液，加入histopaque经密度梯度离心法获得单个核细胞（mononuclear cells, mnc）. 用hanks洗涤mncs 3次，重悬于egm2，调整细胞计数2×109/l，接种于100 mg/l纤连蛋白包被的24孔培养板中. 另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30 cm，pbs冲洗脐静脉腔， i型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min. 收集消化液、离心、洗涤，egm2调整细胞计数2×109/l，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, huvec）用于实验.
1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点， 应用 序列黏附法去除淋巴细胞的混杂. 每例血样在分离出mnc并接种后每隔2 h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入egm2静止培养，4 d后换液. 此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验.
1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用pbs洗涤2次，2.5 g/l胰酶/edta消化后制成细胞悬液，密度为1×109/l. 每份细胞悬液取150 μl×2分装2个试管，分别加入fiticd14，fitccd146，fitckdr，pecd34及同型对照mab各20 μl，避光反应30 min，pbs洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次. 上机后收集20 000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示.
1.2.2内皮细胞vwf的表达贴壁细胞生长至80%汇合时用1∶1甲醇/丙酮固定，vwf一抗及fitc标记的二抗均作1∶50稀释，严格按说明步骤进行.
1.2.3细胞增殖潜能的测定epc及原代huvec生长至亚汇合状态时分别消化，制成稀释的细胞悬液，密度均为2×107/l，传代接种于25 ml培养瓶中. 然后按此方法对这两种细胞分别持续传代，直至细胞衰老. 每传代细胞1次，记数为1次群体倍增. 以培养时间为横坐标，群体倍增次数为纵坐标，绘制细胞群体倍增曲线图.
1.2.4体外血管形成实验用冷藏的egm2配置浓度为2 g/l的i型胶原溶液，100 g/l碳酸氢钠滴定溶液ph值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100 μl，37℃放置30 min使其成胶. 分别将2~3代贴壁的epc和huvec制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况.
1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11 wk，购自郑州大学实验动物中心. 收集epcs和huvecs，制成浓度为2×109/l的细胞悬液. 用1.5 g/l的碳酸氢钠、25 mol/l hepes, 100 ml/l胎牛血清、300 ml/l egm2制备浓度为3 g/l的胶原溶液. 将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢sc细胞胶原溶液1 ml. 将裸鼠置于饲养笼28℃条件下30~60 min，触摸裸鼠移植部位皮丘呈胶冻感为移植成功，然后常规条件饲养. 21~30 d处死裸鼠，取出移植体行病理切片分析.
统计学处理：采用spss 11.0统计软件进行分析. 计量数据以x±s表示，两组均数间的比较采用t检验，以p<0.05为有统计学差异.
2结果
mnc接种后7~11 d可见有簇状聚集的早期克隆出现，中间是圆形细胞，周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞（图1a）. 持续培养至21~28 d可观察到晚期克隆的出现，细胞均呈多角形或纺锤形，紧密贴壁，聚集向外生长（图1b）. 至35~42 d，可见细胞增殖、逐渐汇合成片，呈现内皮细胞典型的“铺路石”外貌（图1c,d）. huvec接种当时为圆形、悬浮，24 h后细胞即伸展、贴壁，呈梭形或多角形（图2a），5~7 d后贴壁细胞基本汇合成单层，外观与epc来源细胞相同（图2b,c）.
2.1epcs与huvecs表型特征对比huvec相比，epc表达高水平的干/祖细胞标记cd34和kdr（p<0.01，图3）. 单核细胞特异抗原cd14在两组细胞表面仅有微量表达，而泛内皮细胞标记cd146在两组细胞均为高表达但无统计学差异. vwf鉴定两组细胞均阳性证实为内皮细胞起源.a：第7日形成早期克隆 ×40；b：第22日形成晚期克隆 ×40；c：第37日晚期克隆增殖汇合；d：晚期克隆再种植形成单层内皮细胞，呈典型铺路石样外观 ×100.
图1epc体外培养细胞形态
a：种植后24 h伸展贴壁 ×40；b：6 d后增殖汇合 ×40；c：第二代huvecs呈铺路石外观 ×100.
图2huvecs体外培养形态特点
2.2epcs及huvecs体外增殖潜能对比epc传代接种后经历1~2 d潜伏适应期，然后增殖旺盛，每3~4 d传代1次. 在100 d时间内，epc传代46次，曲线陡直上升（图4）. 此后传代时间渐延长，曲线由水平转为下降趋势. huvec传代周期为5~7 d，曲线缓慢平坦上升，表明细胞增殖潜能低于epc. 在68 d时间内、同等培养条件下huvec共传代21次，然后曲线迅速下降，提示细胞开始衰老. 在相同的100 d时间内，huvec总计传代25次.
图3epc与huvec表达抗原阳性百分率比较（x±s, n=33, bp<0.01 vs huvec）
图4epc huvecs体外培养群体倍增曲线
2.3胶原凝胶体外血管生成贴壁的epc和huvec分别消化再种植于i型胶原凝胶上，36 h后可见epc伸展呈纺锤状，并相互连接形成管腔样结构（图5a），72 h后可见原管腔增大，管壁可见有细胞向管腔中央呈发芽状生长（图5b）. 持续观察huvec未见形成管腔样结构，至1 wk后仅见细胞呈圆形或多角形融合成片（图5c）.
a：epcs种植36 h形成管腔结构；b：72 h后管腔扩大，并见管壁细胞向腔内呈发芽状生长；c：huvecs种植不能形成管腔结构.
图5胶原凝胶体外血管生成×100
2.4裸鼠体内血管生成裸鼠22只细胞移植均获成功（epc和huvec组各11只），饲养期间未发现裸鼠有异常反应. 移植体病理切片he染色显示，epc组11只裸鼠中有8只在胶原凝胶移植体中观察到了典型的微血管结构，并与小鼠组织构成了人鼠嵌合血管，其间可见小鼠的血细胞流动（图6a）. 而huvec组仅在1只裸鼠的移植体中观察到了类似微血管样结构（图6b），其余10只裸鼠移植体中均显示出不规则的细胞聚集现象，未观察到血管结构（图6c）.
a：epc组细胞移植形成典型血管结构，管腔中可见小鼠血细胞；b：huvec组细胞移植仅1例形成不典型管腔；c：其余huvec组细胞移植均不能形成管腔结构，仅有不规则细胞聚集）.
图6细胞移植裸鼠体内血管生成he ×200
3讨论
本 研究 结果显示，成人外周血循环中的单个核细胞在体外内皮培养条件下，于不同时间段内可形成早期和晚期克隆. yoder等［4］研究表明，这种早期克隆属于单核巨噬细胞系列，再种植不能分化成内皮细胞，因而还不属于真正的epc. 在早期克隆出现后持续培养，直至获得具有内皮细胞形态特征的晚期克隆后，才显现出干/祖细胞和内皮细胞双重生物学特征. 因此，这种晚期克隆及其分化产生的近代细胞，应属于真正的epc. 本研究显示，epc体外再种植培养可呈现典型“铺路石”外观，与huvec形态相同. 两种细胞表达vwf，结合植物凝集素及吞噬乙酰化低密度脂蛋白均为阳性，不表达单核细胞标记cd14而高表达泛内皮细胞标志cd146，提示二者均为内皮细胞来源.与huvec相比，epc表达更高水平的cd34和kdr. 由于cd34是多数干/祖细胞的共有标志，而kdr的高表达预示着细胞对血管内皮生长因子更敏感，增殖力和血管生成能力更强［5］. 由此可见，我们所获得的晚期克隆来源细胞除了具备成熟内皮细胞的全部表型外，还显现出非成熟细胞（即干/祖细胞）的特征.
本研究显示，在同等培养条件下，晚期克隆来源的epc增殖速度快、传代周期短，在100 d时间内传代近50次而无明显衰老征象. 相反，huvec虽然在6代以内的生长方式和细胞形态接近epc，但传代周期进行性延长，在2 mo的时间内只能传代21次即迅速衰老，说明自我复制能力低下，也符合一般成熟细胞的特点. 本研究显示，将晚期克隆来源细胞种植于胶原凝胶中，可生成典型的管腔样结构，而huvec种植后只出现细胞聚集，无典型管腔形成，说明前者具备干/祖细胞和内皮细胞的双重特征. 晚期克隆细胞能够在动物体内增殖并形成血管，因而具有epc完整的生物学特征. 鉴于冠心病患者外周血循环中出现的内皮细胞是自血管壁脱落的衰老细胞，与huvecs相比在体外更不易存活和增殖［6］. 因此有理由相信，我们所获得的晚期克隆细胞属于纯化的epcs，未被成熟血管内皮细胞混杂.
【 参考 文献 】
［1］ gothert jr, gustin se, van eekelen ja, et al. genetically tagging endothelial cells in vivo: bone marrowderived cells do not contribute to tumor endothelium［j］. blood,2004,104(6): 1769-1777.
［2］ dimmeler s, zeiher am, schneider md. unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair［j］. j clin invest, 2005, 115(3):572-583.
［3］ boos cj, lip gyh, blann ad. circulating endothelial cells in cardiovascular disease［j］. j am coll cardiol, 2006, 48(8): 1538-1547.
［4］ yoder mc, mead le, prater d, et al. redefining endothelial progenitor cells analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals［j］. blood, 2007, 109(5):1801-1809.
［5］ dimmeler s. circulating endothelial precursors: identification of functional subpopulations［j］. blood, 2005, 106(7):2231-2232.
［6］ blann ad, woywodt a, bertolini f, et al. circulating endothelial cells. biomarker of vascular disease［j］. thromb haemost, 2005,93:228-235.
