作者：唐尹萍，胡春玲，施婧妮，高建蓉，姚航平，刘焱文

【摘要】  目的 筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分。方法 传代培养的hsc-t6与鳖甲bj61～bj68共同培养72h后，采用mtt比色法测定各浓度组hsc-t6的增殖情况。结果 bj61～bj65和bj68对hsc-t6细胞无抑制作用，而bj66和bj67有较强的抑制作用。结论 bj66和bj67为鳖甲的活性组分。

【关键词】  鳖甲;活性组分;mtt比色法

　　[abstract] objective to screen the active constituent from carapax trionycis. methods secondary culture hsc-t6 in vitro,which was co-cultrued with bj61-bj68 ,then mtt assay was applied to detect the impacts of trionyx sinensis at different concentrations on hsc-t6. results bj61 - bj65 and bj68 had no inhibitory effect on hsc - t6 cells, but bj66 and bj67 had a stronger inhibitory effect on hsc - t6 cells. conclusion bj66 and bj67 is the active constituent from carapax trionycis.

　　[key words] carapax trionycis ;active constituent;mtt

　　鳖甲为鳖科动物鳖 trionyx sinensis wiegmann 的背甲，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效[1]。wWw.11665.CoM鳖甲常用于治疗慢性肝病、预防肝硬化[2～4], 是治疗肝纤维化疾患的常用中药，但鳖甲的活性成分鲜见报道。本实验依据活性筛选的思路, 在高建荣等[5]确定分子量小于6000的多肽为鳖甲抗肝纤维化活性部位的基础上，采用葡聚糖凝胶g-25、葡聚糖凝胶g-15进一步分离为8个组分，再用mtt比色法进一步筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分,为后续的筛选活性单体奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 对象 大鼠肝星状细胞系(hsc-t6)由浙江大学附属第一医院肝病研究所提供。

　　1.1.2 试验药物及主要试剂 (1)试验药物：鳖甲(醋制品)由浙江衢化医院提供，粉碎后过80目筛。(2)细胞培养试剂：胰蛋白酶(trypsin)、非必需氨基酸(neaa)、 high-dmem培养基，gibco产品 ;胎牛血清，武汉三利生物技术有限公司产品;青霉素、链霉素，华北制药股份公司产品;二氧化碳(co2)，武汉市明辉气体科技有限公司。(3)细胞增殖用试剂：二甲基亚砜 (dmso)、噻唑蓝 (mtt)，武汉凌飞科技有限公司。(4) 葡聚糖凝胶g-25、葡聚糖凝胶g-15:北京慧得易公司。

　　1.1.3 仪器 co2培养箱，日本 sanyo公司产品;全自动酶标仪，美国 bio-rad公司产品;倒置相差显微镜，日本olympus公司产品;洁净工作台，上海博迅医疗设备厂产品。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 鳖甲透析物干燥粉末的制备 精密称取鳖甲粉末100g，加200ml双蒸水超声提取20min，抽滤，残渣加水100ml超声10min，抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉。再用少量水将冻干粉溶解，装于透析膜内，用100ml水于4℃透析5h，透析2次，合并膜外溶液，冷冻干燥。最后得鳖甲干燥粉末为淡黄色絮状粉末，即为鳖甲的抗肝纤维化活性肽类物质[5](m<6000)。

　　1.2.2 鳖甲抗肝纤维化活性部位不同组分的分离 称取50g葡聚糖凝胶g-25(sephadex g-25)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.3653g醋鳖甲透析物干燥粉末，用双蒸馏水8ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质分离为8个部位，分别记录为bj1～bj8，其中bj4、bj6和bj7为活性部位[6]。再称取70g葡聚糖凝胶g-15(sephadex g-15)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.4012g bj6样品，用双蒸馏水5ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性部位bj6分离为8个组分。提取分离流程见图1。

　　图1 提取分离流程1.2.3 hsc的培养及传代 将传代的hsc-t6培养于含10% 胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1% neaa的high-dmem培养液中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养;在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约 80%～90%时，是hsc-t6传代的标志;吸弃培养基，加入0.25%胰蛋白酶1～2ml， 37℃ 消化2～3min，待细胞回缩，瓶壁有少量细胞脱落，即用含血清培养基终止;收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700r/min， 4℃离心7min，弃去上清液，加入含 10%胎牛血清的dmem用吸管反复吹打、分散细胞，取细胞悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度 ，以 1×105/ml传代。

　　1.2.4 mtt比色法测定 hsc增殖 传代 hsc-t6细胞按 1×105的密度接种于 96孔培养板，每孔加 100μl，细胞贴壁长满孔底12h后，换用 5%fcs的dmem培养基，培养12h后，分别加入高、中、低剂量bj61～bj68 (以含 5%fcs的 dmem 培养基倍比稀释成16、8、4mg/ml，用0.45μm滤膜过滤)，4孔重复，另设空白对照组(含5%fcs的dmem培养基)。培养72h后，去培养基(翻板)，每孔加20μl mtt溶液。孵育4h，每孔加入 dmso 100μl，在微型混合器上振荡 2min，10min后于酶标仪上0d490值，再按下式计算抑制率：抑制率=(1-药物组od值 对照组od值)×100%

　　1.3 统计学方法 实验结果以x±s表示。应用单因素方差分析，p<0.05表示差异有显著性。

　　2 试验结果

　　传代培养的大鼠肝星状细胞系hsc-t6与不同浓度bj61～bj68样品共同培养 72h后,采用 mtt比色法测定各浓度hsc-t6增殖情况。与空白对照组相比，样品bj66、bj67在各浓度对hsc-t6细胞均有抑制作用，其中高、中浓度差异均有显著性(p<0.05)。结果见表1。表1 鳖甲bj61～bj68对hsc-t6细胞增殖的抑制作用

　　3 讨论

　　肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶段，是各种慢性肝病的共同病理学基础[7]。在肝纤维化形成的过程中，肝星状细胞(hsc)的“持久化”激活和增殖是中心环节[8];阻抑激活的 hsc增殖和诱导促进 hsc凋亡是防治肝纤维化的重要措施[9]。在临床应用上，鳖甲为治疗肝纤维化的传统中药，但鳖甲含有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖等物质，化学成分复杂，因而鳖甲的抗肝纤维化活性单体少见报道。本文在前期实验的基础上，采用葡聚糖凝胶g-15对鳖甲的活性部位bj6进行分离，得到bj61～bj68共8个组分，再采用mtt比色法确定bj66、bj67具有明显抑制大鼠肝星状细胞系hsc-t6的增殖作用，即为鳖甲的抗肝纤维化活性组分;该活性组分的化学成分比bj6少许多，就可以通过制备高效液相色谱分离得到单体，为下一步筛选活性单体打下坚实的基础。

【参考文献】
  　1 国家药典委员会.中国药典，一部.北京:化学工业出版社，2005，266.

　　2 姜宏伟. 单味鳖甲治疗肝炎肝硬化30例. 临床医学,2007，(6):93-94.

　　3 杨杰，谢春娇.鳖甲汤治疗乙肝肝硬化腹水38例.实用中医内科杂志，2005，19(4):362.

　　4 王英凯，王丹，唐彤宇.鳖甲为主的中药治疗肝纤维化的实验室和临床研究.临床肝胆病杂志，2002，18(4):253-254.

　　5 高建蓉，张赤志，邵志华，等.鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究.实用医学杂志，2007，23(11):16-18.

　　6 高建蓉，刘焱文，李昌煜，等.鳖甲抗肝纤维化活性物质的筛选与分离鉴定.中华肝脏病杂志，2010,18(5):341-347.

　　7 徐克成，江石湖.消化病现代治疗.上海：上海科技教育出版社，2001，486;493.

　　8 friedman sl.molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury.j boil chem，2000，275(4): 2247-2250.

　　9 fredman sl， lalazar a， wong l， et al.hsc-t6 cells， an immortalized rat hepatic stellatecell line.hepatology，1997，26(4pt2):338a.