作者：李丰衣,孙劲晖,田德禄,祝世功,潘慧,刘霞,王庆宝
【摘要】 目的 探讨复方鳖甲软肝片对实验性大鼠酒精性肝纤维化的抑制作用及机制。方法 40只wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、中药(复方鳖甲软肝片)治疗组和西药(安珐特)治疗组,以“酒精-吡唑-玉米油”混合液灌胃并饲以高脂饮食16周制备大鼠酒精性肝纤维化模型,给药4周后检测肝纤维化指标、肝组织病理学及肝组织中转化生长因子-β1(tgf-β1)蛋白表达变化。结果 酒精性肝纤维化模型大鼠肝功能显著异常,肝纤维化明显；经4周治疗,与模型组比较,中药组及西药组血清中透明质酸(ha)含量显著下降(p＜0.01),且中药组能显著下调大鼠肝组织中tgf-β1蛋白含量。结论 复方鳖甲软肝片能够有效阻止和逆转酒精性肝纤维化的进程。
【关键词】 复方鳖甲软肝片；酒精性肝纤维化；转化生长因子-β1；大鼠
abstract：objective to probe into the inhibiting action of compound biejiarangan troche on alcohol hepatic fibrosis in rats. methods forty wistar male rats were divided into control, model, compound biejiarangan troche and anfate treatment groups. alcohol hepatic fibrosis model was established by intragastrical perfusion with mixture of “alcohol-pyrazole-coil oil” and high-fat diet for sixteen weeks. after four weeks’ intervention, changes of hepatic fibrosis index, liver tissue pathology and expression of tgf-β1 in liver tissue were observed. results the hepatic function of model rats were changed and abnormal, with obvious fibrosis in hepatic histopathology. after intervention for four weeks, ha decreased (p＜0.01) in serum of compound biejiarangan troche group and anfate group compared with that of model group, and expression of tgf-β1 decreased in compound biejiarangan troche group compared with anfate group. conclusion compound biejiarangan troche has effect of inhibiting and reversing alcohol hepatic fibrosis in rats.
key words：compound biejiaruangan troche；alcohol hepatic fibrosis；tgf-β1；rat
本实验采用“白酒-吡唑-玉米油”混合液灌胃法复制动物模型,观察复方鳖甲软肝片的抗纤维化作用,并探讨其对转化生长因子-β1(tgf-β1)的影响及抗酒精性肝纤维化作用机制。wWw.11665.com
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性wistar大鼠40只,体重(200±10)g,购于北京维通利华公司,许可证号：scxk2004～2005。
1.2 主要药物及试剂
复方鳖甲软肝片由鳖甲、赤芍、冬虫夏草、三七、紫河车、连翘、当归、莪术、党参、黄芪和板蓝根组成,内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产,批号20020501,用前以生理盐水溶解；安珐特,黑龙江卫世医药有限公司生产,国药准字：h23023289。透明质酸(ha)、ⅳ型胶原(cⅳ)及层粘连蛋白(ln)放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。tgf-β1兔抗多克隆抗体(santa cruz),辣根酶标记的羊抗兔二抗,dab显色系统,均购自北京中山生物技术公司。
2 实验方法
2.1 分组及造模
将大鼠随机分成正常组、模型组、中药组和西药组,每组10只。模型组、中药组、西药组采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法复制动物模型[1],每只大鼠灌胃白酒4.8 g/(kg·d)、吡唑24 mg/(kg·d)、玉米油2 ml/(kg·d)的混合液,灌胃16周。在灌胃白酒混合物的同时饲喂高脂饲料(基础饲料-胆固醇-猪大油＝79∶1∶20)。正常组每日用生理盐水灌胃,普通饲料喂养。
2.2 给药
中药组灌胃鳖甲软肝片,给药量0.54 g/(kg·d),西药组灌胃安珐特,给药量21.6 mg/(kg·d),2组均相当于人临床用量的5.4倍,均治疗4周。正常组及模型组每日灌胃2 ml生理盐水。
2.3 观测指标
造模16周后,正常组和模型组大鼠尾静脉采血,分离血清,用放免分析法测定血清中ha、ln及cⅳ含量。治疗4周后,正常组、模型组、中药组和西药组大鼠尾静脉采血,分离血清,测定血清中ha、ln及cⅳ含量。治疗4周后,取各组大鼠肝组织,常规石蜡包埋、切片、he染色、光镜观察,tgf-β1免疫组化染色实验也采用该套石蜡块。
3 统计学方法
应用spss13.0软件包进行统计分析。计量资料用x±s表示,2组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,各组间两两比较采用lsd检验。
4 结果
4.1 用药前后大鼠血清中透明质酸、iv型胶原及层粘连蛋白检测结果
(见表1、表2)表1 用药前2组大鼠血清中ha、ln和cⅳ含量比较(略)注：与正常组比较,*p＜0.05表2 用药后各组大鼠血清中ha、ln和civ含量比较(略)注：与正常组比较,**p＜0.01；与模型组比较,▲▲p＜0.01
4.2 大鼠肝组织转化生长因子-β1蛋白表达免疫组化染色结果
本实验采用免疫组织化学染色方法检测了正常组、模型组、中药组及西药组大鼠肝组织中tgf-β1蛋白的表达情况,结果显示,正常组大鼠肝组织中tgf-β1蛋白仅有少数散在肝细胞阳性表达；模型组大鼠肝组织中tgf-β1蛋白肝细胞弥漫强阳性表达；中药组大鼠肝组织中tgf-β1蛋白部分肝细胞阳性表达；西药组中央静脉周围及肝小叶内较多肝细胞阳性表达。大鼠tgf-β1肝组织免疫组化染色结果初步显示,复方鳖甲软肝片和安珐特均能显著下调大鼠肝组织中tgf-β1蛋白含量,且复方鳖甲软肝片优于安珐特。结果见图1。
4.3 大鼠肝组织石蜡切片mallory染色光镜观察结果
肝组织中的胶原经mallory染色,光镜下呈蓝色。正常组大鼠肝组织中仅有少量胶原表达,肝细胞及汇管区、中央静脉及窦周围几乎不见胶原纤维；模型组大鼠肝组织内胶原水平显著提高,中央静脉及汇管区轻度纤维化；中药组及西药组大鼠肝血窦周围胶原明显减少,相邻血窦间的纤维联络基本消失。mallory染色初步表明,复方鳖甲软肝片在降低肝组织胶原含量上疗效接近安珐特。
5 讨论
目前,肝纤维化的血清标志物主要有ha、ln、cⅳ。ha是一种广泛存在于细胞外基质(ecm)中的高分子多糖,肝纤维化时肝星状细胞(hsc)合成ha增加,而肝内皮细胞对ha降解能力下降,导致血清中ha水平明显增高,其增高程度与肝组织炎症和纤维化程度呈正相关,可作为抗肝纤维化药物治疗动态观察指标。ln是一种糖蛋白,主要存在于基底膜,反映基底膜的更新率。ln在肝组织中含量甚微,当肝窦毛细血管化和汇管区纤维化时,星状细胞大量分泌ln和cⅳ,随着肝纤维化进展而合成增加,血清中ln明显增高。cⅳ在肝内合成和代谢,在肝纤维化发展过程中,肝组织civ过量合成,出现肝窦毛细血管化,使血液中cⅳ异常增加,可能是最早增生的纤维,cⅳ被认为是反映胶原蛋白生成出现最早的重要指标。ln及cⅳ是血管胆管基底膜骨架的主要胶原成分,肝窦内无明显沉着[2-3]。
近年来研究发现,在众多细胞因子中,tgf-β1是最为重要的致纤维化因子。tgf-β1对肝纤维化发生具有特别重要的病理生理学意义。tgf-β1产生时均以非活性状态存在,与相应受体无结合活性。肝受损时,肝内的炎细胞、星状细胞(hsc)、枯否细胞等自分泌或旁分泌非活性tgf-β1 ,非活性tgf-β1被炎症环境中的各种酶和细胞因子激活,刺激上述细胞进一步产生tgf-β1,形成逐级放大效应,导致tgf-β1大量生成和激活。tgf-β1在肝纤维化中的作用具体表现在：①tgf-β1启动和维持肝hsc的活化,促进其增殖；②促进hsc等细胞合成ecm；③抑制基质金属蛋白酶(mmps)的产生,促进金属蛋白酶组织抑制物(timps)的产生,以阻碍胶原的降解[4-6]。
本实验结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏组织ha、tgf-β1蛋白表达和cⅳ表达显著增强,提示ha和tgf-β1参与肝纤维化的发生发展,进一步证实tgf-β1在肝纤维化过程中起重要作用；中药组的肝纤维化程度较模型组减轻,肝组织ha、tgf-β1蛋白表达和cⅳ表达亦显著减弱,提示抑制纤维化肝组织ha、tgf-β1蛋白表达可能是复方鳖甲软肝片的抗肝纤维化的作用靶点之一。复方鳖甲软肝片可能通过下调tgf-β1表达,抑制胶原的合成和降解,从而达到逆转纤维化的目的。
【参考文献】
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