血清药理学与药代动力学整合模型的复方鳖甲软肝片日服用次数合理性研究

　　长期以来，中药日服用次数的规定往往多凭临床医生经验，或由病人自己根据病情轻重缓急主观判断，而这种服药方式是否科学有效却无从得知 [1]。基于效应动力学和药代动力学（即pd/pk）的中药日服用次数研究模式，突出“效”的重要地位，体现中医药整体观，可以阐明和完善其作用机制及组方原理^[2]。因此，在阐明中药量-效关系和保证安全性的基础上，从中药日服次数合理性入手，科学阐释传统中药用法的有效性，去伪存真，将对提高中医药临床疗效产生重大影响。
　　复方鳖甲软肝片具有软坚散结，化窟解毒，益气养血之功，主要用于慢性肝炎肝纤维化， 以及早期肝硬化属癖血阻络，气血亏虚兼热毒未尽证^[3]，是国内首个预防、治疗慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化的药物。本课题采用血清药理学的方法研究复方鳖甲软肝片含药血清体外抗肝纤^[4-8]的效应动力学，综合芍药苷药代动力学研究，探索复方鳖甲软肝片合理的日服用次数，为复方鳖甲软肝片临床合理应用提供科学的参考和依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂 倒置生物显微镜（xds-1b型，北京京瑞天下科技有限公司）； lc-20at高效液相色谱仪 spd-m20a检测器（日本岛津公司）；forma series ii 水套co2培养箱 （3110 series ii 水套，thermo fisher）；数显恒流泵（bt-200b型，上海沪西分析仪器厂）；全波长酶标仪（multiskan go型，thermo scientific）；多管架自动平衡离心机（tdz5-ws型，卢湘仪）。Www.11665.cOm芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110736-200422）；含乙二胺四乙酸（edta）胰酶（批号030702）；胎牛血清（ 美国hyclone公司，批号dpeo166）；二苯基四氮唑蓝（mtt，批号 1324b37）、二甲基亚砜（dmso，20120305224）均购自美国amresco公司；复方鳖甲软肝片（内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司，批号200110901）。
　　1.2 动物 sd大鼠由中国人民解放军军事医学科学院提供，动物许可证号scxk（军） 2007-0004，雄性，体重（200±20） g。饲养实验室为解放军第302医院动物实验中心，温度保持在21～23 ℃，相对湿度（55±5）%。将32只大鼠随机分为4组，每组8只，分为每日给药1次组（g1），每日给药2次组（g2），每日给药3次组（g3）和空白对照组。
　　1.3 血样采集 将32只大鼠灌胃给药， g1组12 g·kg^-1（给药时间为早上9：00）； g2组6 g·kg^-1（给药时间为9：00和13：00）； g3组4 g·kg^-1（给药时间分别为9：00，13：00，17：00）；空白对照组给予等量的生理盐水。分别于给药前及第1次给药后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h，自眼眶后静脉丛取血，同时取2管血液，一管立即以8 000 r·min^-1，4 ℃离心20 min分离上层血清， 56 ℃，灭活处理30 min，过滤除菌，置于-20 ℃冰箱保存，供测定含药血清对hsc-t6增殖的影响用。另一管置于肝素钠浸润的离心管内，8 000 r·min^-1，离心10 min，吸取上层血浆，-20 ℃冷藏，供测定芍药苷血药浓度用。
　　1.4 hsc-t6的分离与培养 按文献方法^[9]分离大鼠肝星状细胞，并用10%胎牛血清dmem培养基，以l×10⁵个/ml的浓度接种，置于培养箱中培养，每3 d更换一次培养液，直至细胞长至亚单层，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶-0.02% edta 消化液37 ℃下消化3～5 min，用培养液以（1～2）×10⁵ 个/ml的浓度接种到新培养瓶中，进行传代培养，传代周期为2～3 d。
　　收集细胞用0.4%台盼蓝溶液鉴定hsc-t6的活力，结果显示活细胞占95%以上；desmin 免疫细胞化学sp法染色对细胞纯度进行鉴定，结果显示原代阳性细胞为90%以上，传代阳性细胞为95%以上。对新分离的hsc-t6在相差显微镜下观察，为折光很强的圆球，24 h后多数细胞贴壁，呈圆形、椭圆形，48 h后大部分细胞伸展生长，72 h后可见部分细胞呈现多角伪足及典型的星状外观。传代后细胞在接种4 h后本文由论文联盟http://收集整理，细胞均贴壁，12 h后细胞伸展生长，约3 d后可长成亚单层。
　　1.5 含药血浆对hsc-t6增殖的影响 取培养24 h的hsc-t6细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02% edta消化，以1×10⁴ ml^-1的浓度，接种于96孔培养板中，每孔体积200 μl，细胞培养24 h后，弃去上清，换无血清培养基，温育48 h。弃去上清，加入20%血浆样品，每组设6个平行孔，作用48 h，吸除上清液，每孔加入5 g·l^-1的mtt液20 μl，继续孵育4 h，加入dmso 200 μl，振荡10 min后，在490 nm波长下，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度a。计算含药血浆的抑制率。a₀，空白对照组血浆吸光度； a₁，给药组含药血浆吸光度。

　　1.6 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含366.8 μg的溶液，即得。
　　1.7 血浆样品的的处理 血浆样品室温下解冻后精密吸取100 μl，加入100 μl的4.5%高氯酸（ph 0.72）^[10-11]，于涡旋液体混合器上震荡2 min，1万 r·min^-1，离心10 min，取上清液，20 μl进样分析。
　　1.8 高效液相色谱法测定芍药苷含量 色谱柱为alltimatm c₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.05 mol·l^-1磷酸二氢钾溶液（30∶70） ；流速1.0 ml·min^-1；检测波长230 nm ；柱温25 ℃。
　　1.9 专属性 取大鼠空白血浆、空白血浆加入芍药苷对照品的样品、给药后的大鼠血浆样品，按照1.7项下方法处理后，注入液相色谱仪进行测定。
　　1.10 线性关系考察 分别精密量取36.68 mg·l^-1的小檗碱对照品贮备溶液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 ml，分别置10 ml的量瓶中，加甲醇至刻度，各取100 μl置具塞离心管中，在37 ℃条件下经氮气流吹干后，精密加入空白血浆100 μl，涡旋混合30 s，按照1.7项下方法处理并测定，以芍药苷浓度（x）对峰面积（y）作线性回归，绘制标准曲线。
　　1.11 精密度 以上制得的3.668 mg·l^-1的芍药苷血浆标准品，批内平行测定6次，每次20 μl，计算精密度。
　　1.12 回收率 取空白血浆100 μl于1.5 ml离心管中，加入芍药苷对照品溶液，涡旋混合均匀，使得相应血浆药物质量浓度分别为0.733 6，3.668，11.004 mg·l^-1，按1.7项下方法处理后，进高效液相色谱测定，记录芍药苷峰面积（a）；另配制相应浓度的芍药苷对照品溶液测定，记录芍药苷峰面积（ao），a/ao即为提取回收率。
　　1.13 复方鳖甲软肝片中芍药苷的含量测定 取本品20片，精密称定，研细，取细粉0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇10 ml，密塞，冷浸1 h，时时振摇，滤过，弃去初滤液，取续滤液，按1.8项下方法测定芍药苷含量，进样量10 μl，经测定，复方鳖甲软肝片每片含芍药苷4.660 7 mg。
　　1.14 数据处理 用das 2.1.2软件对含药血浆抑制率-时间（e-t）曲线进行数据分析，组间比较采用one-way anova分析，p<0.05时认为具有显著性差异；药代动力学数据采用房室模型进行拟合；相关性分析采用spss 17.0软件中的pearson双变量相关分析进行数据分析，p<0.05时认为具有显著性差异。
　　2 结果
　　2.1 含药血浆对hsc-t6抑制的效应动力学 不同给药次数的复方鳖甲软肝片含药血清对hsc-t6抑制率的效应动力学见图1。含药血清可明显抑制hsc-t6的增值，3组的auce分别为578.188±33.620， 656.955±24.877， 625.979±23.904，且g1，g2，g3之间具有显著性差异（p<0.05），见图2，不同给药次数的复方鳖甲软肝片含药血清对hsc-t6抑制率的效应动力学结果表明，g2>g3>g1。
　　2.2 芍药苷的药代动力学研究 专属性：本实验选定的色谱条件下，目标峰在（14.7±0.08） min处出峰，血浆中内源性物质不干扰芍药苷的含量测定，本方法专属性良好，见图3。
　　标准曲线：芍药苷在0.733 6～11.004 mg·l^-1
　　范围内线性关系良好，线性回归方程为y=261.19x-23.636，r=0.998 9（n=5）。
　　精密度：血浆中芍药苷的日内精密度rsd<2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。
　　回收率：测得的3个浓度的回收率分别为71.06%，75.63%，79.38%，满足生物样品测定的需求。
　　每日灌服不同次数的复方鳖甲软肝片后，在不同时间点采血并按建立的方法测定其血药浓度，得到芍药苷血药浓度-时间曲线，见图4；芍药苷血药浓度-时间数据利用das 2.2.1进行拟合，大鼠每日不同次数灌服复方鳖甲软肝片后，芍药苷在大鼠体内药动学符合二室模型，各自的药代动力学参数，见表1。
　　结果显示，通过对给予复方鳖甲软肝片后血中芍药苷的药代动力学研究，由于单次给药剂量的不同，其中cmax的大小为g1>g2>g3，但第2次，第3次给药后g2组、g3组cmax分别在6， 10 h达到5.15，3.11 mg·l^-1； g1，g2，g3组的auc0-t分别为37.258，37.579，25.758 mg·l^-1·h^-1，即g2>g3>g1，g1，g2的auc0-t与g3组比较有显著性差异（p<0.05），g1与g2组无显著性差异，且g2组能明显延长药物半衰期，说明每日给药2次可使药物较长时间维持较高的血药浓度，提高生物利用度。因此，复方鳖甲软肝片芍药苷药代动力学研究结果表明，g2>g3>g1。
　　2.3 效应动力学与药物代谢动力学相关性研究 将g1，g2，g3组的血药浓度数据与其相应的效应动力学数据进行pearson相关性检验。g1，g2，g3组的血药浓度数据与对hsc-t6抑制的pearson相关系数分别为0.855，0.889，0.876，p均为0.000，结果表明，芍药苷血药浓度与对hsc-t6抑制的效应具有显著相关性。
　　3 结论与讨论

　　本实验首次将血清药理学方法用于中药复方日服用次数药效学的研究，用体外分离培养的 hsc-t6作为肝纤维化细胞模型。从药效方面来看，每日服用2次复方鳖甲软肝片能够较大程度抑制hsc-t6体外的增殖，而芍药苷药代动力学结果也表明每日给药2次时，芍药苷血药浓度能够在较长时间维持较高浓度，相对生物利用度较高。综合效应动力学和药代动力学研究，本研究认为复方鳖甲软肝片用于慢性肝炎肝纤维化以每天服用2次为佳。
　　化学药物可以通过成分的药代动力学特征规定药物的用法与用量，但中药特别是复方是通过多成分的协同作用起效，单纯测定其中一个成分的药代动力学不足以代表中药在体内的行为特征，而且仅以药代动力学数据进行给药方案的设计未考虑中药的整体观，也忽略了临床治疗效果的重要意义。将效应动力学与药代动力学结合来研究的中药日服用次数是体现中医药整体观的中药用法研究模式，本研究中复方鳖甲软肝片含药血清对hsc-t6抑制的效应动力学与芍药苷药代动力学呈良好的相关性，而在研究过程中也认识到单一成分不能代表整个复方的药代动力学^[12-13]。因此，在后续研究中，本课题组将继续以pd/pk为中心，以体外多效应指标代替体内效应指标，以多成分的整合药代动力学代替单一成分的药代动力学，使中药日服用次数研究更具有科学性、实用性。
　　中药日服用次数研究与药物临床治疗给药方法联系紧密，本文将复方药代动力学与血清药理方法结合，来用于解决临床实际问题，从而使长期以来中药临床治疗给药的盲目性和经验性的现象有了科学方法的确证，为中药临床试验用药方案提出了新的研究思路，为中药临床合理用药的安全性和有效性提供更为科学合理的理论依据。将复方药代动力学与血清药理方法结合研究中药日服用次数对于阐明药物作用机制、评价临床用药是否合理、探明药效个体差异的来源、模拟临床试验等方面具有十分重要的作用。对本研究的继续探索将有助于开启中药复方临床药理学的新的研究的领域。