鳖甲炮制前后对肝星状细胞增殖影响的比较研究
【关键词】 鳖甲;炮制前后;肝星状细胞 ; mtt法
【摘要】 目的 比较鳖甲生品和醋制品对大鼠肝星状细胞(hsct6)增殖的影响，为鳖甲醋制品抗肝纤维化的临床应用提供依据。方法 传代培养的hsct6与鳖甲生品和醋制品超声提取物，鳖甲生品和醋制品回流提取物共同培养72h后，采用mtt比色法测定各浓度组hsct6的增殖情况。结果 两种提取方式相互验证了鳖甲生品和醋制品对hsct6细胞增殖均有抑制作用， 且鳖甲醋制品的作用优于鳖甲生品。结论 鳖甲醋制品的抗肝纤维化作用优于鳖甲生品。
【关键词】 鳖甲;炮制前后;肝星状细胞 ; mtt法
comparative study on influence of preandpostprocessed trionyx sinensis carapace on hepatic stellate cell proliferation
shi jingni,hu chunling,tang yinping,et al.provincial and the ministry of education key laboratory of resource science and chinese herbal compound in chinese medicine,hubei college of traditional chinese medicine，wuhan 430061,china
[abstract] objective to compare the imfluence of the crude and processed trionyx sinensis carapace on rat hepatic stellate cell proliferation(hsct6),thus toguide the clinical application of trionyx sinensis carapace on the the treatment of liver fibrosis.methods secondary culture hsct6 in vitro,which was cocultrued with the extracts (two extractions:ultrasonic and reflux) from raw and prepared trionyx sinensis carapace,then mtt assay was applied to detect the impacts of trionyx sinensis carapace extracts at different concentrations on hsct6.results the crude and processed trionyx sinensis carapace can both inhibit proliferation of hsct6,and the antiproliferation effects on hsct6 were enhanced after processing,which was muturally authenticated by ultrasonic extraction and reflux extraction.conclusion the processed trionyx sinensis carapace has better function in antiliver fibrosis than the crude.
[key words] trionyx sinensis carapace;preandpostprocessed;hepatic stellate cell;mtt
鳖甲为鳖科动物鳖( trionyx sinensis wiegmann) 的背甲[1]，始载于《神农本草经》，收载于历年版《中华人民共和国药典》，具有滋阴潜阳，软坚散结，退热除蒸的功效，是治疗肝纤维化疾患的常用中药。wWW.11665.Com以鳖甲配伍组方的中药复方制剂复方鳖甲软肝片、鳖甲抗纤方、鳖甲煎丸等均具有较好的抗肝纤维化作用[2～4]。肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶段，是各种慢性肝病的共同病理学基础[5]。在肝纤维化形成的过程中，肝星状细胞(hsc)的“持久化”激活和增殖是中心环节[6];阻抑激活的 hsc增殖和诱导促进 hsc凋亡是防治肝纤维化的重要措施[7]。关于鳖甲药材的现代临床应用，有人主张生品入药，有人推崇醋制品，莫衷一是。因此，探讨鳖甲炮制前后对hsc增殖的影响，对于指导鳖甲在临床上用于治疗肝纤维化疾患具有重要的现实意义。本实验采用两种提取方式，分别对鳖甲炮制前后的肝星状细胞增殖抑制作用进行了比较研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 大鼠肝星状细胞系(hsct6) 浙江大学附属第一医院肝病研究所提供。
1.1.2 试验药物及主要试剂 (1)试验药物：鳖甲由浙江衢化医院提供，按2005版《中国药典》净制(生品)和醋制(醋制品)，粉碎后过80目筛。(2)细胞培养试剂：胰蛋白酶(trypsin)、非必需氨基酸(neaa)、 highdmem培养基，gibco公司产品 ;胎牛血清，武汉三利生物技术有限公司产品;青霉素、链霉素，华北制药股份公司产品;二氧化碳(co2)，武汉市明辉气体科技有限公司。(3)细胞增殖用试剂：二甲基亚砜 (dmso)、噻唑蓝 (mtt) ，武汉凌飞科技有限公司。
1.1.3 仪器 co2培养箱，日本 sanyo公司产品;全自动酶标仪，美国 biorad公司产品;倒置相差显微镜，日本olympus公司产品;洁净工作台，上海博迅医疗设备厂产品。
1.2 方法
1.2.1 鳖甲提取物的制备
1.2.1.1 鳖甲超声提取物的制备 (1)称取醋鳖甲粉(80目)25g，加蒸馏水100ml，超声50min，抽滤，药渣再加50ml蒸馏水，超声50min，抽滤，合并两次滤液，冷冻干燥后得冻干粉，为样品ⅰ。(2)生鳖甲按上述方法制备得到样品ⅱ。
1.2.1.2 鳖甲回流提取物的制备 (1)称取醋鳖甲粉(80目)25g，加蒸馏水100ml，100℃回流提取2h ，抽滤，药渣再加50ml蒸馏水， 100℃回流提取2h，抽滤，合并两次滤液，冷冻干燥后得冻干粉，为样品ⅲ。(2)生鳖甲按上述方法制备得到样品ⅳ。
1.2.2 hsct6的培养及传代 将传代的hsct6培养于含10% 胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1%neaa的highdmem培养液中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养;待细胞在培养瓶中生长至铺满瓶底60%以上面积时，即可用0.25%胰蛋白酶消化30秒至1分钟左右，当细胞开始收缩、间隙增大时立即弃去消化液，静置约30秒至1分钟左右，加入含10%胎牛血清的highdmem培养液，轻轻吹打贴壁细胞使之成为均匀的细胞悬液，取10μl细胞悬液光镜下计数，用培养基调整细胞浓度 ，以 1×105/ml传代。
1.2.3 实验分组及药物处理 待细胞长满培养板底后 ，换用 5%胎牛血清的dmem培养基 ，培养 24h后分别加入高、中、低剂量鳖甲药液(以含 5%胎牛血清的 dmem 培养基倍比稀释成56.000 0mg/ml、28.000 0mg/ml、 14.000 0mg/ml，用0.45μm滤膜过滤)，4孔重复，另设空白对照组(含5%胎牛血清的dmem培养基)。
1.2.4 mtt比色法测定 hsct6增殖 传代 hsct6细胞按1×105的密度接种于 96孔培养板，每孔加 100μl，细胞贴壁长满孔底12h后 ，换含5%胎牛血清的dmem培养基，培养12h后，加入高、中、低剂量鳖甲药液。每一浓度设4复孔，另设空白对照组，去培养基(翻板)，每孔加20 μl mtt溶液;孵育4h，每孔加入 dmso 100 μl，在微型混合器上振荡2min，10min后于酶标仪上测定 od490值。抑制率=(1-药物组od值/对照组od值)×100%
1.3 统计学处理 实验结果以(x±s)表示。应用单因素方差分析，p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 鳖甲生品和醋制品超声提取物对hsct6细胞增殖的影响 传代培养的hsct6与不同浓度样品ⅰ、样品ⅱ共同培养 72h后,采用 mtt比色法测定各浓度hsct6增殖情况。与空白对照组比较，样品ⅰ在各浓度对hsct6细胞均有抑制作用，其高、中浓度均差异有非常显著性，且高浓度抑制率达82.82%(p<0.01)。与空白对照组比较，样品ⅱ在各浓度对hsct6细胞均有抑制作用，其高、中浓度差异有非常显著性，最高抑制率为73.51%(p<0.01);但与相应浓度样品ⅰ比较，样品ⅱ抑制作用较弱，且各浓度差异均具有显著性，结果见表1。表1 鳖甲超声提取物对hsct6细胞增殖的抑制作用注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01;与相应浓度分子量>6 000物质组相比，△p<0.05
2.2 鳖甲生品、醋制品回流提取物对hsct6细胞增殖的影响 与空白对照组比较，样品ⅲ在各浓度对hsct6细胞均有抑制作用，其高、中浓度均差异有非常显著性，且高浓度抑制率达75.45%(p<0.01)。与空白对照组比较，样品ⅳ在高、中浓度对hsct6细胞均有抑制作用，低浓度差异无显著性;但与相应浓度样品ⅲ相比，样品ⅳ抑制作用较弱，其高、中浓度差异具有显著性，结果见表2。表2 鳖甲回流提取物对hsct6细胞增殖的抑制作用注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01;与相应浓度分子量>6 000物质组相比，△p<0.05
3 讨论
我国传统医学治疗肝病时，采用醋制鳖甲入药[8]。中医理论认为，生鳖甲养阴清热，潜阳熄风之力较强，用于热病伤阴或内伤虚热，虚风内动等证。醋制入肝、肾经，鳖甲砂炒醋淬后，质地酥脆，能增强药物入肝消积，软肝散结的作用。在现代临床应用中，有人主张鳖甲生品入药，他们认为，鳖甲为动物药，其药效物质为蛋白质和肽类化合物，炮制后有效成分可能遭到破坏。本项研究结果表明，鳖甲醋制品和鳖甲生品均具有抗肝纤维化的作用，且鳖甲醋制品的药效优于生鳖甲。实验室前期研究发现小分子肽类成分为鳖甲抗肝纤维化的活性成分之一[9]。且有文献报道[10]，醋鳖甲无论是从出膏、游离总氨基酸含量和总肽含量上均比生鳖甲大幅度提高，尤其是浸出物、肽的含量提高2倍以上。因此笔者认为，鳖甲经过高温醋淬后，部分大分子蛋白变性为活性小分子肽类物质，从而增大了活性肽类成分的含量或产生了新的活性肽类成分，有利于增强鳖甲抗肝纤维化的作用。因此，本实验的研究结果为鳖甲醋制品的临床用药提供了一定的科学依据。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典(一部)，2005年版.北京：化学工业出版社，2005,266.
2 苗韫晗.复方鳖甲软肝片治疗40例肝纤维化临床观察.当代医学,2009,15(22):140.
3 梁润英,路嵘.鳖甲抗纤方抗肝纤维化作用的实验研究.中国中医药科技,2004,11(1):1618.
4 蔡永江,刘红春，刘旺根，等.鳖甲煎丸抗肝纤维化作用的实验研究.中医研究,2007,20(11):2123.
5 徐克成,江石湖.消化病现代治疗.上海:上海科技教育出版社，2001,486,493.
6 friedman sl.molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury.j boil chem，2000，275(4)： 22472250.
7 fredman sl，lalazar a，wong l，et al.hsct6 cells，an immortalized rat hepatic stellatecell line.hepatology，1997，26(4 pt 2)：338a.
8 徐忠可.金匮要略论注.上海：上海古籍出版社，1991,56.
9 陈进文，高建蓉，邵志华，等.鳖甲抗肝纤维化活性物质的氨基酸分析.氨基酸和生物资源，2008，30(3)：7980.
10 刑延一.鳖甲炮制工艺及寡肽类化学成分的研究.北京：北京中医药大学，2007.
