作者：袁洁,何振健,朱勋,吴珏珩
【摘要】 目的研究一种来源于海洋微生物次级代谢产物的新型黑麦酮酸d衍生物d69对人乳腺癌的体内外抑制活性，并初步探讨其分子机理。 方法 通过镜下观察以及mtt比色法检测d69的细胞毒作用，构建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型研究d69体内抗肿瘤活性。 结果 d69对人乳腺癌细胞系mda-mb-435和zr-75-30的生长具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性增强。其对mda-mb-435和zr-75-30细胞半数抑制浓度(ic50)分别为0.031 μmol/l和0.036 μmol/l，而对人永生化乳腺上皮细胞hmec的抑制作用较低，ic50为0.686 μmol/l。人乳腺癌裸鼠移植瘤模型验证d69能显著抑制在体肿瘤的生长。 结论 d69可能是一种潜在的乳腺癌化疗药物的先导化合物。
【关键词】 海洋微生物;黑麦酮酸d衍生物;抗肿瘤;人乳腺癌;人乳腺癌裸鼠移植瘤模型
abstract:objectiveto investigate the in vitro and in vivo anti-breast cancer activity of d69,a novel member of secalonic acid family,which was derived from marine commensal microorganisms.methods the inhibitory effects of d69 on growth of breast cancer cell lines and the human mammary epithelial cell line were determined by mtt assay.in addition,the in vivo antineoplastic effect of d69 on balb/c-nude mice bearing human breast cancer cell line mda-mb-435 was investigated.results the ic50 values of d69 on mda-mb-435 and zr-75-30 cell lines after 48 h treatment were 0.031 μmol/l and 0.036 μmol/l,respectively.in contrast,inhibition of the growth of the immortalized breast epithelial cells,hmec by d69,with an ic50 of 0.686 μmol/l,was far milder than that of the inhibition on human breast cancer cells.treatment with d69 markedly suppressed the growth of sarcoma xenograft in syngeneic balb/c-nude mice in a time-dependent manner,and the reduction in tumor growth rate was significant in xenografts treated with 200 μg/kg d69.conclusion these data suggested that d69 might be used as a promising chemotherapeutical agent for treatment of breast cancer and other solid cancers.
key words:marine microorganisms; secalonic acid d analog; antitumor; human breast cancer; nude mice bearing human cancer cell
据美国癌症协会(american cancer society)的统计，2007年全世界新增癌症病例约1 200万，死于癌症的人数约760万，也就是说,平均每天约有2万人死于癌症[1]。WWW.11665.cOm其中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在北美、澳大利亚、北欧和西欧等西方发达国家其发病率非常高[2]。传统的天然抗癌药物一般来源于陆上植物以及陆栖微生物的提取，但是随着几十年长时间的开发，陆上被开发出的新活性物质的概率越来越小，难度也越来越大。于是，人们希望从海洋生物中分离得到新的活性物质[3]。自20世纪50年代始，随着光谱学、高通量筛选以及结构分析技术等的发展，已从海洋生物中分离筛选到如ecteinascidin-743、aplidine、bryostatin 1、黑麦酮酸d素等多种具有结构多样且效果较好的抗肿瘤活性物质 [4-8]。d69是从海洋源性的一株链霉菌菌株的次生代谢产物中分离得到的一种化合物，含有环状的五肽内酯环和发色基团，属于新型的黑麦酮酸d衍生物。通过对其体内外具有潜在的抗肿瘤活性的研究，从细胞和分子水平上初步探讨d69对人乳腺癌细胞生长的抑制作用和诱导凋亡作用，为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人乳腺癌细胞系mda-mb-435和zr-75-30、人永生化乳腺上皮细胞系hmec(human mammary epithelial cell)均为本实验室保存，并已在本实验室已发表的其他研究项目中使用[9]。
1.1.2化合物d69由中山大学化学与化学工程学院林永成教授提供。其结构运用核磁共振(h-nmr、13c-nmr、 hsqc、hmbc)、高分辨质谱 (esi-ms )等进行初步鉴定[10]。各种化合物由二甲基亚砜(dmso)(sigma公司)制备保存母液。
1.1.3实验动物清洁级雌性balb/c裸鼠，体质量18～20 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：scxk(粤)2008-0020，粤监证字：2008a004。在中山大学实验动物中心动物实验部以spf条件饲养，实验动物许可证号：syxk(粤)2007-0081。
1.2方法
1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞系mda-mb-435和zr-75-30培养于含5%(φ)胎牛血清、2 mmol/l l-谷氨酰胺、0.1 mmol/l非必需氨基酸、10 mmol/l hepes、100 iu/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的dmem完全培养基中，置于37 ℃、5%(φ)co2孵箱中孵育培养;传代时先用1× pbs清洗细胞，再用含0.02%edta的0.05 %胰酶消化，以dmem完全培养基终止消化。人乳腺上皮细胞hmec培养于无血清ksfm培养基中，置于37 ℃、5%co2孵箱中孵育培养;传代时用上述胰酶消化，以胰酶抑制剂终止消化。以上细胞培养相关试剂均为invitrogen/gibco公司产品，胎牛血清购自hyclone公司。
1.2.2四甲基偶氮唑蓝(mtt)法检测细胞增殖将mda-mb-435、zr-75-30和hmec细胞消化后重悬并计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%co2孵箱中孵育培养。24 h后去除培养基，更换为含浓度依次为0、0001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/l d69的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5 mg/ml mtt (genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/ml，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存)溶液20 μl，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入dmso 150 μl,振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570 nm下的吸光度a值。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均a值-实验组平均a值)/对照组平均a值×100 %。对照组即d69浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度(ic50)计算软件bliss’s software计算ic50，应用spss软件进行数据统计分析。
1.2.3d69抑制人乳腺癌细胞系mda-mb-435生长的体内实验每只balb/c裸鼠右侧乳腺接种数生长期的人乳腺癌细胞mda-mb-435细胞5×106(100 μl)。接种肿瘤后第6天，将14只裸鼠随机等分为2组。待瘤直径在30~50 mm后，以30 μg/kg剂量的d69，每2天腹腔注射给药1次，持续30 d，观察并记录d69的体内抑瘤作用。肿瘤体积计算公式：体积(mm3)=长径×短径2×π/6。根据各组皮下移植瘤体积，计算各个时间点肿瘤体积的均数值并绘制肿瘤生长曲线。d69注射29 d后，处死，迅速取下肿瘤标本，称重。抑制率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》(中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988)。
1.2.4统计学分析数据结果以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异具有显著性。
2结果
2.1d69对人乳腺癌细胞系mda-mb-435、zr-75-30生长和形态的影响
在倒置光学显微镜下观察d69处理后细胞生长情况及形态学变化，发现d69对于人乳腺癌细胞系mda-mb-435、zr-75-30的生长具有显著的抑制作用(见图1、2)。随着d69浓度的增加，细胞生长抑制及细胞死亡现象越来越明显，出现大面积的脱落，细胞及细胞碎片漂浮液面。这种细胞形态的改变与细胞凋亡所发生的形态改变十分的相似[11]。[psa6681;s*2〗 图1人乳腺癌细胞mda-mb-435经不同浓度d69处理后的形态变化(200×,48 h)figure 1morphological changes of human breast cancer cells mda-mb-435 treated with indicated concentrations of d69(200×,48 h)
2.2d69对人永生化乳腺上皮细胞hmec生长和形态的影响
为检测d69对非肿瘤细胞的毒性，以人永生化乳腺上皮细胞hmec为模型，在倒置光学显微镜下观察d69处理后的细胞生长情况及形态学变化，发现与对照组相比，d69对hmec细胞生长的抑制作用较人乳腺癌细胞mda-mb-435和zr-75-30要小得多(见图3)。
2.3d69对mda-mb-435、zr-75-30和hmec细胞生长的抑制效应
mda-mb-435、zr-75-30和hmec细胞分别以不同浓度的d69处理48 h，mtt结果显示，d69以剂量依赖型的方式抑制人乳腺癌细胞mda-mb-435和zr-75-30的增殖。其中对mda-mb-435细胞的抑制率最高，其作用48 h后的ic50为0.031 μmol/l。其次是zr-75-30细胞，ic50为0.036 μmol/l，而d69对于人永生化乳腺上皮细胞hmec的抑制率最低，ic50为0.686 μmol/l，见图4。[psa6682;s*3〗图2人乳腺癌细胞zr-75-30经不同浓度d69处理后的形态变化(200×,48 h) figure 2morphological changes of human breast cancer cells zr-75-30 treated with indicated concentrations of d69 (200×,48 h) [psa6683;s*2〗图3人永生化乳腺上皮细胞hmec经d69处理后的形态变化(200×，48 h)figure 3morphological changes of hmec treated with indicated concentrations of d69 (200×,48 h)
2.4裸鼠异体移植瘤模型中d69的体内抗肿瘤作用
体内抗肿瘤实验证明，与对照组相比，给药组能显著地抑制肿瘤的生长，其肿瘤抑制率为81.11%，差异具有显著性，对肿瘤的抑制效果更为明显。实验过程中，小鼠的体质量并没有明显的改变。见图5、表1。[psa6684;s*2〗图4d69对mda-mb-435、zr-75-30和hmec细胞生长的剂量-效应曲线
3讨论
能够产生黑麦酮酸系列化合物的真菌广泛分布于各种陆地和海洋[12-14]。到目前为止，已经有6种(a、b、c、d、e、f、g)不同的黑麦酮酸被发现。研究表明，黑麦酮酸d比其他5个同系物具有更强的药理活性，同时具有更小的毒性 [15]。本文所涉及的活性化合物d69是从南海海洋微生物的次生代谢产物中筛选得到的，具有黑麦酮酸基本骨架的一种结构新颖的黑麦酮酸d衍生物。
本文研究了黑麦酮酸d衍生物对人乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。mtt体外实验结果显示，d69对于人乳腺癌细胞mda-mb-435和zr-75-30的增殖具有明显的抑制作用，ic50分别为0.031 μmol/l和0.035 μmol/l;而对于人永生化乳腺上皮细胞hmec的抑制率最低，这说明对于乳腺癌细胞来讲，d69对于肿瘤细胞的选择性毒性较强，而对于非肿瘤的永生化乳腺细胞毒性较弱。为了进一步确认d69的抗肿瘤活性以及其对正常细胞、组织的低毒副作用，本文建立了稳定的人mda-mb-435乳腺癌移植瘤裸鼠模型，结果表明，d69对于裸鼠体内乳腺癌移植瘤的生长亦具有显著抑制作用，且小鼠的体质量没有明显的改变。体内和体外实验结果均提示d69是一个非常有希望的具有抗肿瘤活性的小分子化合物，但其抗肿瘤的分子机制及细胞内分子靶点还有待于进一步的实验探讨。
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