摘要】 目的 研究新型katp开放剂iptakalim对原代培养人肺动脉平滑肌细胞katp通道亚基sur2b/kir6.1 mrna表达的影响，以探讨iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制。 方法 分离人手术标本正常肺组织3～4级肺小动脉，原代培养人肺动脉平滑肌细胞。正常组不予干预，试验组分别加入内皮素1（et1）、et1+不同浓度iptakalim或glyburide等孵育24 h。以trizol法抽提总rna，逆转录为cdna，以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（rqrtpcr）法检测各组细胞katp通道 mrna表达量。 结果 et1组sur2b mrna的表达量较正常组明显减少。iptakalim呈浓度依赖性拮抗et1作用，提高sur2b mrna表达量。glyburide呈浓度依赖性拮抗iptakalim作用，减少sur2b mrna表达量。各组kir6.1 mrna表达量无统计学差异。 结论 新型katp开放剂iptakalim呈浓度依赖性增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞katp通道mrna表达量，可能成为较有前途治疗肺动脉高压的有效药物。
【关键词】 atp依赖性钾通道开放剂 iptakalim 人肺动脉平滑肌细胞 实时荧光定量聚合酶链反应
effects of iptakalim on mrna level of katp channel in human pulmonary artery smooth muscle cells li qingling.department of respiratory medicine,the first hospital of xuzhou,xuzhou 221002,china; zhou yanjuan, zhu yuming, wang hong， xie weiping. department of respiratory medicine, the first affiliated hospital of nanjing medical university, nanjing 210029, china
【ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ to study the effect of iptakalim on mrna expression of atpsensitive potassium（katp） channels of primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells. ｍｅｔｈｏｄｓ the specimens were obtained from patients undergoing partly pulmonary resection. intrapulmonary arteries (3rd-4th division) were dissected clean from adventitia and opened longitudinally. the tissue and smooth muscle cells were primary cultured. except for no intervention for normal group, other groups were incubated with endothelin1 (et1), et1 and different concentration of iptakalim or glyburide for 24 h. total rna was extracted by trizol and reversely transcribed into cdna. realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (rqrtpcr) was used to measure the level of mrna expression of katp channels. ｒｅｓｕｌｔｓ et1 suppressed the expression of sur2b mrna compared with control group. iptakalim increased the expressions of sur2b mrna and inhibited the effect of et1 in concentrationdependent manner. glyburide suppressed the expressions of sur2b mrna and inhibited the effect of iptakalim. there were no significant differences in the expression of kir6.1 mrna among all groups. ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ iptakalim increases the expression of katp channel mrna in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells and can be a candidate for therapy of hypoxia pulmonary artery hypertension in future.
【key ｗｏｒｄｓ】 katp channels openers; iptakalim; human pulmonary artery smooth muscle cell; realtime quantitative polymerase chain reaction
低氧性肺动脉高压（hpah）是慢性阻塞性肺疾病（copd）及其他肺部疾病发展为慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程,目前治疗乏术。www.11665.coMhpah的病理生理基础是肺小动脉平滑肌细胞（pasmc）收缩、增殖及肺小动脉重构。研究表明，hpah时内皮素1（et1）、血管紧张素ⅱ（angⅱ）等缩血管物质增加，一氧化氮（no）、前列腺素i2（pgi2）等舒血管物质减少。这些物质作用于pasmc膜katp通道，使其功能及表达受抑制，继而产生肺血管收缩。持续肺血管收缩刺激血管增生、重构、产生肺动脉高压及右心室肥厚[1]。因此，katp通道在hpah发病中处于关键环节，成为研发治疗hpah新型药物的重要靶分子[2]。
iptakalim是我国自行设计、具有自主知识产权的新型katp开放剂，磺结构不同于以往的katp开放剂，对磺脲类受体（sur2b）靶向性更强[3]。本课题组已在动物模型、细胞、电生理、分子水平研究发现： iptakalim可以降低hpah大鼠肺动脉压力[4]，舒张豚鼠哮喘模型气道平滑肌[5]，抑制大鼠肺动脉平滑肌增殖细胞核抗原（pcna）的表达[6]，增加hpah大鼠pasmc膜katp通道sur2b亚单位mrna表达[7]。考虑到人与动物间的物种差异，iptakalim对人类肺血管平滑肌作用可能存在差异，本实验采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（rqrtpcr）法以经典katp开放剂pinacidil为对照，研究iptakalim对原代培养人pasmc膜katp通道 mrna表达的影响，揭示hpah发生发展的分子生物学机制，为iptakalim应用于临床提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 iptakalim（纯度99.36%）由军事医学科学院药理和毒理研究所馈赠。et1、pinacidil、glyburide（katp开放剂抑制剂）购自美国sigma公司。dulbecco’改良的eagle培养液（dmem）、胎牛血清（fbs）和胰酶购自美国gibco公司，trizol购自美国invitrogen公司，sybr green realtime pcr kit 购自日本toyobo公司。 depc、mmlv、5×buffer、oligo（dt）15、rna酶抑制剂和dntps购自美国promega公司。实时定量pcr仪为rotorgene 3000，购自澳大利亚corbett research 公司。
1.2 细胞培养及分组 pasmc来自江苏省人民医院胸外科因周围型肺癌1期（2例）、肺错构瘤（1例）行部分肺叶切除患者术后标本中正常肺组织。患者术前诊断无copd、慢性肺源性心脏病等肺部其他疾病。实验经患者知情同意，江苏省医学伦理委员会的审核批准。无菌条件下，于4 ℃ hanks溶液中分离3～4级肺小动脉，刮去内皮细胞及外膜，将标本制成1～3 mm2大小，置于dmem培养基中加入20%fbs，链霉素100 μg/ml，青霉素100 u/ml，两性霉素2.5 μg/ml于37 ℃培养箱中培养（含5%co2，95%空气）。细胞相差显微镜下呈特殊的“峰谷”形态，经鼠抗α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（αsam），免疫细胞化学染色证实为平滑肌细胞，纯度95%。取第3～5代细胞为实验用细胞。正常组不予干预措施，其余组于提取细胞总rna前，分别以et1、et1加不同浓度iptakalim及glyburide等共同孵育细胞24 h。分为正常组、et1组（10 nmol/l）、et1 10 nmol/l(以下各组同)+iptakalim 0.1 μmol/l组（a组）、et1+iptakalim 1 μmol/l组（b组）、et1+iptakalim 10 μmol/l组（c组）、et1+pinacidil 10 μmol/l组（d组）、et1+ iptakalim 10 μmol/l+glyburide 0.1 μmol/l组（e组）、et1+iptakalim 10 μmol/l+ glyburide 1 μmol/l组（f组）、et1+iptakalim 10 μmol/l+glyburide 10 μmol/l组（g组）、et1+pinacidil 10 μmol/l＋glyburide 10 μmol/l组（h组）。
1.3 细胞总rna提取 以trizol法抽取细胞总rna。以紫外分光光度计以a260/a280测取rna浓度。
1.4 引物设计 引物序列为：sur2b （genbank accession no. af061324）上游（5′atatggtcaaatctctacctggagg3′），sur2b下游（5′catgtctgcgcgaacaaaagaagc3’），扩增产物大小：350bp；kir6.1（e12830）上游（5′ttggccagaaagagtatc ccggag3′），kir6.1下游（5′cattccacttttctccatgtaagc 3′），扩增产物大小：300bp；βactin上游（5′agcgcaagtactccgt gtg3′），βactin下游（5′aagcaatgctatcacctccc3′），扩增产物大小：501bp。
1.5 逆转录反应 将rna 2 μg加入oligo（dt）15 0.5 μl，70 ℃变性5 min，立即置于冰水中冷却1 min，加入mmlv 1 μl，5×buffer 4 μl，rna酶抑制剂0.5 μl，10 mmol/l dntp 1 μl，加depc处理水至20 μl。反应条件为37 ℃ 60 min，95 ℃ 10 min。
1.6 rqrtpcr反应体系为20 μl，包括sybr green realtime pcr master mix 10 μl，cdna 1 μl，上下游引物各0.4 μl，三蒸水8.2 μl。反应条件为94 °c 4 min，循环时94 °c 30 s，58 °c 30 s，72 °c 45 s，共45个循环，末次延伸72 °c 10 min。每个样本pcr反应时均在同样条件下做阴性对照（三蒸水）、阳性对照（dna）及内参对照（βactin）。分别对3名患者标本进行扩增，每个标本重复3次。经证实目的基因及内参扩增效率一致。
1.7 产物鉴定 取上述rqrtpcr产物10 μl，加上样缓冲液2 μl，与βactin 6 μl一起上样，2 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，拍照留底。
1.8 统计学分析 以2-△△ct法分析。△ct为每组ct目的基因-ct内参，△△ct为每处理组△ct-对照组△ct值（et1+iptakalim各组以et1组为对照，加用glyburide后各组以et1+ iptakalim 10 μmmol/l为对照进行比较）。计算各组2-△△ct值，即代表各组起始目的基因相对于对照组的倍数，即相对定量。采用平均值±标准差(±s）方式表示，使用spss 13.0软件分析。组间对比采用t检验，多重对比采用方差分析（anova）。p ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
katp通道各亚单位mrna表达测定显示，et1组sur2b mrna的表达量较正常组明显减少，仅为正常组的0.09±0.01倍（p＜0.05）。
与et1组比较，加入iptakalim 0.1 μmmol/l、1 μmmol/l、10 μmmol/l后，sur2b mrna的表达量逐渐升高。iptakalim呈浓度依赖性拮抗et1对sur2b mrna的表达抑制。iptakalim浓度为10 μmmol/l时可完全拮抗et1作用，et1+iptakalim 10 μmmol/l组sur2b mrna表达量与正常组相仿（p＞0.05，见表1）。et1+iptakalim 10 μmmol/l组与et1+pinacidil 10 μmmol/l组sur2b mrna表达量无统计学差异（p＞0.05）。见表1。表1 iptakalim 对sur2b/kir6.1 mrna表达量的影响（n=3)
2-△△ct值正常组et1组a组b组c组d组sur2b11.10±0.69 1*1.04±0.02*3.18±0.21*△10.76±0.61△10.94±1.13△kir6.11.37±0.30 11.06±0.051.16±0.011.2±0.891.27±0.18
注：与正常组比较，*p＜0.05；与et1组比较，△p＜0.05 与et1+iptakalim 10 μmmol/l组比较，加入glyburide 0.1 μmmol/l、1 μmmol/l、10 μmmol/l 后，sur2b mrna的表达量逐渐下降。glyburide呈浓度依赖性拮抗iptakalim的作用。glyburide浓度为10 μmmol/l 时可完全拮抗iptakalim 作用，et1+iptakalim 10 μmmol/l+glyburide 10 μmmol/l组sur2b mrna的表达量与et1组相仿（p＞0.05）。et1+ iptakalim 10 μmmol/l+ glyburide 10 μmmol/l组与et1+pinacidil 10 μmmol/l＋glyburide 10 μmmol/l组sur2b mrna表达量无统计学差异（p＞0.05）。见表2。 表2 glyburide 对iptakalim作用后sur2b/kir6.1 mrna表达量的影响（注：与et1组比较，*p＜0.05；与c组比较，△p＜0.05 各组间kir6.1 mrna的表达量均无统计学差异。
各组产物经2%琼脂糖电泳鉴定为目的基因，电泳结果见图1。
注：m为marker,1泳道为sur2b 350bp，2泳道为kir6.1 300bp,3泳道为βactin 501bp
图1 正常人pasmc katp通道亚基电泳图3 讨论
hpah发病过程中，钾通道活性与血管的舒缩状态密切相关。钾通道关闭时，k+外流减少，细胞内k+浓度增加，细胞膜去极化。持续膜去极化引起l钙通道开放，钙内流增加，同时肌浆网钙储存库释放ca2+，细胞内游离ca2+增多，血管平滑肌收缩；钾通道开放时，细胞膜超极化，电压依赖性ca2+通道关闭，钙内流减少，血管平滑肌舒张。
katp通道是由内向整流性钾通道（inwardly rectifying potassium channel subunits，kir6.x）家族和磺脲类受体（sulfonylurea receptor，sur）家族组成的异源性八聚体[（sur/kir6.x）4]。不同组织katp通道亚型不同，存在于人pasmc katp通道由sur2b/kir6.1组成，尚未发现sur2a，sur1，kir6.2亚单位[8]。
在正常生理状态下，由于细胞膜内生理浓度atp的存在，肺动脉平滑肌膜katp通道不开放，故可能不参与调控肺循环的基础张力[9]。急性肺部缺氧时，glyburide可拮抗肺血管收缩反应后的肺动脉张力下降，提示katp通道开放是急性缺氧时肺血管舒张的原因之一，也是机体重要的代偿机制[10]。katp通道在调控pasmc收缩和增殖、调节血管重构方面均发挥主要作用[11]。
et1是hpah时由血管内皮细胞分泌的强力缩血管活性肽，是导致katp通道功能及表达下降的重要物质，在肺血管重构、肺动脉高压中发挥重要的调节作用[12]。本实验以et1模仿hpah时细胞内环境，结果进一步证实et1使人类pasmc膜katp通道sur2b mrna表达量减少。
本课题组先前动物研究发现iptakalim呈浓度依赖性增加hpah大鼠肺动脉平滑肌细胞膜外向性钾电流，减轻肺动脉重构及右心室肥厚[13]，减少兔pasmc内ca2+浓度，抑制pasmc增殖[14]。最新研究显示，iptakalim可拮抗et1诱导的人pasmc增殖[15]。本实验结果与以上结果一致，iptakalim呈浓度依赖性拮抗et1对sur2b mrna的抑制作用，提高其表达。特异性katp拮抗剂glyburide呈浓度依赖性拮抗iptakalim的作用。et1、iptakalim对katp通道亚单位kir6.1影响不明显。以上结果可以推断iptakalim通过调节人类pasmc膜katp通道sur2b亚基发挥作用，与国外学者研究结果相仿[16]。
因此，本研究从分子生物学水平证实我国自行研究设计的新型katp通道开放剂iptakalim通过增加pasmc膜katp通道sur2b mrna表达，调节pasmc膜katp通道表达及功能，拮抗慢性缺氧时et1对katp通道的抑制，抑制pasmc收缩与增殖，可能成为治疗肺动脉高压较有前途的新药。
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