【摘要】 目的测定返魂草中硒多糖含量。方法采用回流提取法和微波超声波协同提取法提取样品中的硒多糖，利用正交实验确定微波超声波协同提取法的最佳提取条件；用硫酸-蒽酮法测定返魂草中硒多糖含量；用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中微量元素硒。结果回流提取法提取得粗硒多糖含量为5.100%，回收率97.83%，精密度0.95%；微波超声波协同提取法提取得粗硒多糖含量为5.395%，回收率97.93%，精密度1.170%；石墨炉原子吸收法测得粗硒多糖中硒含量为24.4μg/g，回收率97.64%,精密度1.901%。结论微波超声波协同提取法提取的返魂草中硒多糖含量高于回流提取法提取的返魂草中硒多糖含量，因此，微波超声波协同提取法是一种快速、灵敏的提取方法。
【关键词】 返魂草； 硒多糖； 石墨炉原子吸收法； 硒
麻叶千里光senecio cannabifolius lessl.又名宽叶返魂草, 为菊科千里光属多年生草本植物,主要分布于我国东北、河北等地及朝鲜、日本、前苏联远东地区, 生长于山沟林缘及湿草甸上, 该植物具有散瘀、止血、止痛的功效［1］, 在民间被广泛用于感冒、炎症的治疗。千里光属植物含有吡咯里西啶类生物碱, 该类生物碱的体内代谢物具有肝、肾损害等毒性作用, 已被英国、澳大利亚等国以安全性问题为由禁止使用, 使该属药材及其制剂的生产、销售和使用面临非常不利的局面。因此, 对千里光属药材进行系统的化学成分、药效和安全性评价十分必要［2］。Www.11665.COm
近年来,由于多糖大量的生物活性功能以及在功能食品和临床上的广泛使用,使多糖生物资源的开发和利用研究日益活跃,成为天然药物、生物化学、生命科学领域的研究热点。到目前为止,已有三百多种多糖类化合物从天然产物中被分离出,其中从植物,尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要,研究也十分活跃。
由于硒多糖在生物体内的含量甚少,因此国内外对硒多糖的存在形态及硒多糖中痕量硒的分析报道非常有限。生物体中微量的硒多糖以及硒多糖中超微量的硒限制了人们对硒多糖的深入研究,只有超高灵敏度的检测技术才有可能满足分析硒多糖中痕量硒的要求。本文采用蒽酮-硫酸法测定返魂草中硒多糖的含量，用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中的硒含量。
1 仪器与试剂
1.1 材料与试剂返魂草产自延边地区。乙醇、丙酮、乙醚、硫酸、蒽酮均为分析纯。硒标准储备液均为国家标准溶液（ncs），实验用水均为二次蒸馏水及娃哈哈纯净水。
1.2 仪器及工作条件fz102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；数显式电热恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司) ；fa2104n电子天平(上海精密科学仪器公司)；cw-2000型微波超声波协同萃取仪（上海新拓微波溶样测试技术有限公司）；tas-990型原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。石墨炉原子吸收仪器的工作条件见表1～2。
实验所用玻璃仪器均经稀硝酸浸泡12 h以上，然后经自来水、蒸馏水、去离子水依次洗净烘干备用。
2 方法与结果
2.1 样品处理用蒸馏水反复冲洗返魂草，于60 ℃恒温箱中干燥，然后用微型植物粉碎机粉碎装瓶备用。
2.2 返魂草中硒多糖的提取
2.2.1 回流提取法称取返魂草全草用30～100目粉碎机粉碎，称取10.0 g置圆底烧瓶中，加入乙醚200 ml，回流提取70 min，然后抽滤，弃去滤液，将滤渣小心转移至烧瓶内，用乙醚冲净滤纸上的滤渣一起转移至圆底烧瓶内，再加入乙醚200 ml，回流提取60 min，同样方法进行抽滤转移，再用150 ml乙醚回流提取60 min，使滤液基本无色。将滤渣风干除去其中乙醚，转移至干净的圆底烧瓶中，用200 ml去离子水沸水回流3次，30 min/次，趁热过滤，合并滤液，将滤液至电炉上浓缩至50 ml，加入无水乙醇200 ml，使醇含量为80%。静置过夜，滤过。沉淀再加水溶解，加乙醇至醇含量为80%静置过夜，取沉淀分别用无水乙醇、丙酮依次洗涤3次，20 ml/次，置45 ℃烘干后可得棕色粗多糖0.51 g。表1 tas-990型石墨炉原子吸收分光光度计工作条件（略）表2 tas-990石墨炉的硒元素测定加温程序（略）
2.2.2 微波超声波协同提取法精确称量返魂草样品6份各10.00 g，根据单因素实验和正交实验得出的最佳条件，在最佳优化方案下即料液比为1∶35，提取功率为250 w,提取时间为180 s条件下提取，按照“2.2.1”项方法进行平行测定6次，得到10.00 g返魂草中粗多糖提取率分别为5.41%，5.56%，5.33%，5.28%，5.34%，5.45%，粗多糖平均提取率5.395%。
2.3 返魂草中粗硒多糖纯度测定
2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制将一定量葡萄糖标准品粉末于107 ℃烘干至恒重，精确称取葡萄糖标准品粉末0.020 g于100 ml容量瓶中，定容、摇匀。精确量取葡萄糖标准品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml,分别置10 ml量瓶中,纯化水定容,摇匀,再分别精密量取2.0 ml,置干燥具塞试管中,加入蒽酮-硫酸试剂4.0 ml,立刻摇匀,冷却至室温置于暗处。同时以2.0 ml去离子水,加蒽酮-硫酸试剂4.0 ml作空白。在620 nm波长处测定吸收度。以葡萄糖含量（μg/ml）为横坐标,吸光度(a)为纵坐标进行回归,得回归方程为：y = 0.007 2x+ 0.008 7,r2=0.998 5。
2.3.2 粗硒多糖溶液的制备及纯度测定精确量取粗硒多糖0.030 g，加入去离子水溶解，转移至100 ml容量瓶中。精密量取配好溶液1.0，2.0，3.0 ml各3份,置干燥具塞试管中,各加蒽酮--硫酸试剂4.0 ml,立即摇匀,冷却至室温,按“2.3.1”项下操作。
粗硒多糖纯度按下式计算： 粗硒多糖纯度（%）=(a-0.0087)×100/0.0072×vw×106
(a:吸光度；w:量取粗硒多糖质量；v:取液量)
根据三组数据0.351,0.698,1.040计算得粗硒多糖平均纯度为15.9%，由返魂草中粗硒多糖平均提取率为5.395%(“2.2.2”所得),所以返魂草中硒多糖含量为5.395%×15.9%=0.86%。
2.4 加样回收率实验精密量取粗硒多糖溶液1.0,2.0,3.0 ml,分别加入葡萄糖标准品溶液1.0,2.0,3.0 ml置10 ml量瓶中,再分别量取4.0 ml蒽酮-硫酸试剂置干燥具塞试管中在620 nm 波长处测定吸收度。结果见表3。
表3 回收率实验结果（略）
2.5 精密度实验分别精密取同一供试液5 份,每份2.0 ml,置干燥具塞试管中,各加蒽酮-硫酸试剂4.0 ml,立即摇匀,冷却至室温, 按“2.3.1”项下操作,计算精密度。结果rsd为0.95%和1.17%。表4 精密度实验（略）
从表4中可以看出，本实验的相对标准偏差在5%以内，说明本实验的重现性好，测定结果可信。
2.6 返魂草粗硒多糖中硒元素的测定
2.6.1 硒标准曲线的绘制精确量取硒标准溶液1 ml,用纯水定容到1 000 ml,得到浓度为1μg/ml的母液，取母液0 , 0.4 , 0.8 , 1.2 ,1.6 , 2.0 ml定容到10 ml , 得se浓度分别为0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 μg/ml，用石墨炉原子吸收分光光度计在上述工作条件下测定其吸光度值。根据测定的吸光度值计算出回归方程和相关系数：回归方程y=1.233 6x+0.002 1，（其中x为se标准液浓度，y为吸光度）；相关系数为0.999 8。
2.6.2 粗硒多糖溶液的配制精确称取返魂草粗硒多糖0.365 g，加纯净水定容于100 ml容量瓶中。然后分别取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml于10 ml容量瓶中，用纯净水定容至刻度。
2.6.3 硒元素的检测结果粗硒多糖中se的含量计算公式为：
mse=(a-0.0021) ×10×1001.2332×v×w
mse——粗硒多糖中se的含量；a——测定吸光度；v——取液量；w——称取粗多糖质量
测定结果见表5。表5 多糖中硒元素含量的测定（略）
由以上4组数据得粗多糖平均含硒量为：mse=24.33 +24.38+24.77+24.41）/4×0.365 = 24.47（μg / g）
2.7 精密度实验对粗糖样品液中se元素进行吸光度值测定，结果见表6。表6 se元素的变异系数（略）
从表6中可以看出，本实验的相对标准偏差rsd在5%以内，说明本实验的重复性好，测定结果可信。
2.8 准确度实验吸取一定量的样液进行返魂草粗多糖中se的回收率实验。测定结果见表7。表7 返魂草中se的回收率（略）
由表7可见，测量的回收率在一定范围之内，说明测量的准确度高。
2.9 检出限se的检出限为：0.5 ng/ml，可能是由于：①乙炔气体不纯，造成原子化温度的稳定性不好；②注射器内有小气泡；③空白溶液的值偏高。
3 讨论
3.1 两种提取方法的比较回流提取法得粗硒多糖含量为5.100%，回收率97.83%，精密度0.95%；微波超声波协同提取法得粗硒多糖含量为5.395%，回收率97.93%，精密度1.170%。由结果看出微波超声波协同提取法比回流提取法提取率稍高些。
回流提取法提取时间长，步骤较复杂，在料液转移过程中容易出现误差；微波超声波协同提取法直接将振动与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用了超声波振动的空化作用（同时具有萃取和机械搅拌作用）以及微波的高能作用。进而使样品得到充分的作用，从而最大限度地将样品中的有效成分提取出来，既省时，又可节约原材料。
3.2 硒多糖及硒的功效硒和多糖同样对许多疾病具有防治作用,近年来对多糖和硒活性的研究已经较为深入,但将多糖与硒有机结合成为硒多糖,国内外的研究尚处于起步阶段。硒与多糖的有机结合形成硒多糖将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。然而对硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚,尤其是从分子生物学的角度对硒多糖的构效关系,以及作用机制等方面研究的直接证据和实验更显不足,因此采用现代分离分析技术对硒多糖进行深入研究是非常必要的。
多糖具有抗肿瘤和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等广泛的生物学活性。硒与多糖的有机结合形成硒多糖将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。
硒是谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心元素，在清除自由基、分解过多的过氧化氢、减少过氧化物、保护细胞膜、保护细胞敏感分子dna, rna中占有重要地位。硒在机体中多以蛋白形式存在。其主要生理功能有参与酶的催化反应;调节维生素a, c, e, k的吸收与消耗;在机体代谢和电子传递中起作用;增强机体免疫能力;增强人的生育能力及生殖能力。硒缺乏可能会导致克山病、大骨节病、恶性营养不良、甲状腺激素代谢疾病、免疫力低下等，一些动物实验提出低硒可能对心血管疾病发生起作用。硒还具有抗肿瘤、抗癌作用。
目前还无研究返魂草中硒多糖的报道，本文采用蒽酮-硫酸法测定了返魂草中硒多糖的含量，用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中的硒含量，返魂草中硒多糖及微量元素硒不仅与该植物具有散瘀、止血、止痛的功效有密切的关系，硒多糖本身作为一种活性多糖，必然与其生物活性，如免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖有直接的关系。因此返魂草中硒多糖及微量元素硒是影响其药理作用的不可忽视的重要方面，硒元素与返魂草中其它化合物的有机结合或与各种有机物特殊的络合形式对返魂草药理作用的影响尚不清楚，有待进一步研究探索。
【参考文献】
［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草，第7册［m］.上海：上海科技出版社，1999：943.
［2］吴斌 ,林文辉 ,高慧媛,等 .麻叶千里光抗菌化学成分的研究 ( ⅱ)［j］.中草药,2005,36(10) :1447.
