作者：杨荣平，向春艳，张小梅，秦伟瀚，励娜
【摘要】 目的比较不同产地翼首草中总皂苷的含量。方法采用紫外分光光度法，以齐墩果酸为对照品，香草醛冰醋酸和硫酸溶液为显色剂，测定波长为535 nm。结果在25.35～45.63 μg范围内，齐墩果酸的吸光度与含量线性关系良好,相关系数r=0.999 9。平均回收率为91.94%，rsd为0.87%(n=9)。结论不同产地翼首草中总皂苷含量差异不大，但根中总皂苷的含量可能比全草中高。
【关键词】 翼首草; 总皂苷; 紫外分光光度法; 含量测定
翼首草为川续断科植物匙叶翼首草pterocephalus hookeri (c. b. clarke) hoeck的干燥全草，是藏医常用植物药，主产于西藏、青海、甘肃、四川等地。具有解毒除瘟，清热止痢，祛风通痹的功效。其主要成分为熊果酸(又名乌索酸，ursolic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)等三萜皂苷类化合物[1]，此外还含有生物碱、多糖等化学成分。本实验采用紫外分光光度法，详细考察了影响总皂苷提取的6个主要因素，确定了最佳制备方法，并对13批不同主产地和不同药用部位的翼首草中的总皂苷含量进行了比较。www.11665.Com
1 仪器与试药
uv-1601紫外-可见分光光度仪(日本岛津);bs 224s 电子天平(十万分之一，德国赛多利斯);aeg-45sm电子分析天平(日本岛津);hh-s型水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)。熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742-200516);齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505)，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每毫升含齐墩果酸0.845 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.2 供试品溶液制备方法的考察
2.2.1 提取溶媒和水解方式的考察[2]取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，分别加无水乙醇30 ml，甲醇30 ml，再加浓盐酸3 ml，于80℃水浴回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加蒸馏水10 ml超声溶解，用醋酸乙酯振摇提取4次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇转移至10 ml量瓶中，并加无水乙醇稀释至刻度，得供试品溶液a，b。
取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，分别加无水乙醇30 ml，甲醇30 ml，于80℃回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣分别加hcl(3→10)10 ml水解2 h,按供试品溶液a制备，从“用醋酸乙酯”起依法操作，得供试品溶液c，d。
精密吸取供试品溶液a、b、c、d各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量分别为6.07%，5.38%，1.47%，1.69%。结果表明，提取溶媒为无水乙醇，加3ml浓盐酸，回流提取和水解同步进行时，所得总皂苷含量最高。
2.2.2 无水乙醇用量的考察取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，分别加无水乙醇10，20，30，40 ml，浓盐酸3 ml，于80℃回流2h，按“2.2.1”项下供试品溶液a制备，从“滤过”起依法操作，即得。精密吸取上述供试品溶液各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量分别为5.69%，5.83%，6.06%，5.48%。结果表明，无水乙醇用量为30 ml时，所得总皂苷含量最高。
2.2.3 提取温度的考察取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，加无水乙醇30 ml，浓盐酸3 ml，分别于80，90，100℃水浴回流2h，按“2.2.1”项下供试品溶液a制备，从“滤过”起依法操作，即得。精密吸取上述供试品溶液各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量分别为6.07%，6.31%，6.20%。结果表明，提取温度为90℃时，所得总皂苷含量最高。
2.2.4 水解时间的考察取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，加无水乙醇30 ml，浓盐酸3 ml，于90℃分别回流1，2，3，4 h，按“2.2.1”项下供试品溶液a制备，从“滤过”起依法操作，即得。精密吸取上述供试品溶液各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量分别为5.84%，6.30%，6.59%，6.41%。结果表明，水解时间为3h时，所得总皂苷含量最高。
2.2.5 萃取次数的考察取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，加无水乙醇30 ml，浓盐酸3 ml，于90℃水浴回流3 h，滤过，滤液蒸干，残渣加蒸馏水10 ml超声溶解，分别用醋酸乙酯振摇提取2，3，4，5次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇转移至10ml量瓶中，并加无水乙醇稀释至刻度，即得。精密吸取上述供试品溶液各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量分别为5.85%，6.26%，6.60%，6.63%。结果表明，振摇提取4次和5次所得总皂苷含量相差不大，因此选择振摇提取4次。
2.2.6 药材粉碎度的考察 取翼首草粉末(分别过2，3，4，5号筛)约0.1 g，精密称定，加无水乙醇30 ml，浓盐酸3 ml，于90℃水浴回流3h，按“2.2.1”项下供试品溶液a制备，从“滤过”起依法操作，即得。精密吸取上述供试品溶液各适量于具塞试管中，按“2.3”项下依法显色测定吸光度，计算含量为6.59%，6.37%，6.31%，6.30%。结果表明，药材粉碎过2号筛所得总皂苷含量最高。
总结供试品溶液制备方法：取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g，精密称定，加无水乙醇30 ml，浓盐酸3 ml，于90℃水浴回流3 h，滤过，滤液蒸干，残渣加蒸馏水10 ml超声溶解，用醋酸乙酯振摇提取4次，每次10 ml，合并醋酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇转移至10 ml量瓶中，并加无水乙醇稀释至刻度，即得。
2.3 标准曲线的制备精密吸取“2.1”项下齐墩果酸对照品溶液30，36，42，48，54 μl于具塞试管中，水浴蒸干，分别精密加入5%香草醛冰醋酸溶液0.6 ml，70%硫酸溶液5 ml，摇匀，于70℃水浴加热40 min，取出，冰水浴冷却1 h，室温放置1 h，以相应试剂为空白，于535nm处测定吸光度。以齐墩果酸的含量(μg)为横坐标(x)、齐墩果酸吸光度(a)为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算得直线回归方程为：y=0.014 1x+0.042 0(r=0.999 9)。结果表明，齐墩果酸在25.35～45.63 μg范围内，线性关系良好。
2.4 精密度考察 取同一对照品溶液，按“2.3”项下方法重复测定吸光度6次，计算得rsd为0.097%。结果表明，仪器精密度良好。
2.5 稳定性考察 精密吸取“2.1”项下齐墩果酸对照品溶液30μl，“2.2.6”项下过2号筛供试品溶液60 μl于具塞试管中，按“2.3”项下方法显色。计时测定，隔30 min测定一次吸光度值，共测定3 h，计算得rsd分别为0.92%和0.75%。结果表明,对照品溶液及供试品溶液在显色操作完成后3 h内稳定。
2.6 重复性实验 取翼首草粉末(过2号筛)约0.1 g(6份)，精密称定，按拟定的供试品溶液制备方法操作，精密吸取所得供试品溶液各60 μl，再按“2.3”项下方法测定吸光度，计算得平均含量为6.58%，rsd为1.21%。结果表明，此方法重复性良好。
2.7 加样回收实验精密称取已知总皂苷含量(6.58%)的样品9份，分别按样品中总皂苷含量的80%，100%和120%精密加入对照品，每个梯度3份。按拟定的供试品溶液制备方法和“2.3”项下测定方法操作，计算回收率。结果见表1。表1 回收率考察(±s)样品号药材称样量m/mg样品中总皂苷含量m/mg加入齐墩果酸量m/mg测得量m/mg回收率(%)平均回收率%
由上表可见，由于样品前处理较复杂，回收率在90%～94%之间，符合药典规定。
2.8 样品含量测定取不同产地及不同药用部位的翼首草13批药材粉末(过2号筛)各0.1 g，精密称定，按拟定的供试品溶液制备方法操作，精密吸取各批供试品溶液50～60 μl，再按“2.3”项下方法测定各批次总皂苷含量。结果见表2。表2 样品含量测定产地药用部位批次数平均含量(%) 四川带根全草66.04 甘肃带根全草35.66 青海带根全草15.53 西藏根38.13
从表2可以看出，不同产地的带根全草翼首草总皂苷的含量差异不大，但四川产的翼首草总皂苷的含量略高。而西藏所采的3批翼首草根总皂苷的含量却又明显高于其他产地的带根全草。
3 讨论
从线性、精密度、稳定性、重复性及加样回收率等实验结果可以看出，用紫外分光光度法测定翼首草中总皂苷的含量准确、稳定、灵敏。本法可作为药材含量测定标准之一。
显色时，所用显色试剂均须临用新配，否则反应不完全，测得的含量降低;测定前应避免暴露于强光之下和剧烈晃动，因为不利于硫酸稳定，影响吸光值的准确性。
本实验首次详细考察了影响翼首草总皂苷提取的6个主要因素，分别是提取溶媒和水解方式、溶媒用量、提取温度、水解时间、萃取次数、药材粉碎度。确定了最佳制备方法，其中提取溶媒和水解方式对总皂苷提取的影响最大。
从13批不同产地和不同部位总皂苷的含量分析，以西藏所采的3批翼首草根的总皂苷含量明显高于其他产地翼首草带根全草的含量，提示根中总皂苷的含量有可能高于全草，还需要对同一产地，同一批次不同部位总皂苷的含量进行比较来进一步的证实。
【参考文献】
[1] 田 军，吴凤锷，丘明华，等.匙叶翼首花的化学成分[j].天然药物研究与开发，2000，12(1)：35.
[2] 何正友，张 艺，张 旭.分光光度法测定藏药翼首草中总皂苷的含量[j].华西药学杂志，2002，17(1)：43
