作者：叶静 肖美添，汤须崇，黄雅燕
【摘要】 目的 建立测定甘草药材中甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b含量的方法。方法 采用hplcelsd法，hypersil c18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，以甲醇乙酸铵水溶液(0.2 mol/l) 冰乙酸(体积比65∶34∶1)为流动相，流速1.0 ml/min， elsd漂移管温度110 ℃， 载气(n2) 流速2.8 l/min。 结果 甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的线性范围分别为6.02～120.4，13.22～264.4，6.32～126.4 μg/ml(r值分别为0.999 6,0.999 7,0.999 8),平均回收率(n=6)为100.6%，100.8%和99.87%。结论 本法简便，重现性好，可用于甘草中甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b含量的测定。
【关键词】 甘草;甘草皂苷g2;甘草酸铵;乌拉尔甘草皂苷b;hplcelsd
abstract:objective o establish a quantitative method for determining the content of saponin g2, ammonium glycyrrhizinate and uralsaponin b in glycyrrhiza uralensis. method hplcelsd method was used to analyze the three constituents. samples were separated on an hypersil c18 column (5 μm, 4.6 mm×150 mm) by using methanol0.2 mol·l-1 ammonium acetateglacial acetic acid (65∶34∶1) as mobile phase. the flow rate was 1.0 ml·min-1 and the temperature of drift tube was set at 110 ℃. the gas flow (n2) was set at 2.8 l·min-1. results the linear ranges of saponin g2, ammonium glycyrrhizinate and uralsaponin b were 6.02-120.4, 13.22-264.4 and 6.32～126.4 μg·ml-1, respectively and their average recoveries(n=6) were 100.6%，100.8% and 99.87% , respectively. conclusion the method is convenient, reliable and can be used for analyzing saponin g2, ammonium glycyrrhizinate and uralsaponin b in glycyrrhiza uralensis.
key words:glycyrrhiza uralensis; saponin g2; ammonium glycyrrhizinate; uralsaponin b; hplcelsd
甘草是豆科植物glycyrrhiza uralensis fisch的干燥根茎和根,是常用且重要的中药材,具补脾和胃、益气复脉之功效[1]。WWW.11665.cOM 现代 研究发现甘草具有祛痰、止咳、利胆、解痛、降胃酸、抗炎、抗溃疡、抗肝毒素以及抗癌等药理作用[2]。近年来还发现其具有体外抗甲肝病毒、人体免疫缺陷病毒和sars病毒的活性,临床上用于 治疗 慢性肝炎和艾滋病[3,4]。我国野生甘草主要生长在“三北”地区，尤其是内蒙古、甘肃、新疆、宁夏分布较多。甘草中主要有效成分为甘草皂苷类和黄酮类化合物[5]。有关甘草有效成分分离测定， 文献 报道的有tlc法[6]、gc法[7]和hplc法[8], 为了更好地控制甘草的品质，本文采用hplcelsd法测定甘草中3种皂苷类成分甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的含量。
1 仪器与试药
shimadzu spd10a vp 高效液相色谱仪(配备cbm102色谱工作站)，alltech elsd 2000型蒸发光散射检测器，超纯水器(milipore)。
甘草药材购自江西省樟树药材市场，经本实验室鉴定;甘草皂苷g2、甘草酸铵和乌拉尔甘草皂苷b 对照品为本试验室用制备型hplc 分离而得, 经ir、ms、1hnmr、13cnmr 等手段(方法)鉴定结构，hplc法测定含量，以峰面积归一化法 计算 ，含量均大于99.0%。乙腈、甲醇(色谱纯，merck 公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：hypersil c18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);流动相:甲醇0.2 mol/l乙酸铵水溶液冰乙酸(体积比65∶34∶1);流速1.0 ml/min;柱温为室温;进样量：20 μl;elsd 检测器检测参数：漂移管温度110 ℃;载气(n2) 流速2.8 l/min。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于2 000, 在此条件下甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b 达到基线分离, 且各自峰形较好，色谱图见图1。
2.2 对照品及供试品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品甘草皂苷g2 3.01 mg、甘草酸铵6.61 mg、乌拉尔甘草皂苷b 3.16 mg，置同一25 ml量瓶中加适量甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。实验前以0.45 μm滤膜滤过，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粗粉约0.5 mg，精密称定，加入约30 ml流动相，超声提取3次，每次30 min，合并提取液，滤过，放冷，加流动相定容至100 ml量瓶中，即得供试品溶液。实验前以0.45 μm滤膜滤过，备用。
2.3 线性试验
分别精密量取上述混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 ml于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μl。分别以峰面积的积分值为纵坐标，对照品的质量浓度(μg/ml)为横坐标，得3种成分的线性回归方程分别为：
甘草皂苷g2： y=201.1x-79.038(r=0.999 6)，线性范围为6.02～120.4 μg/ml;
甘草酸铵：y=90.79x-28.499(r=0.999 7)，线性范围为13.22～264.4 μg/ml;
乌拉尔甘草皂苷b：y=189.9x-28.499 (r=0.9998)，线性范围为6.32～126.4 μg/ml。
2.4 精密度试验
取混合对照品溶液(甘草皂苷g2 48.16 μg/ml、甘草酸铵105.76 μg/ml、乌拉尔甘草皂苷50.56 μg/ml)20 μl，重复进样6次，测得甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的峰面积rsd分别为0.74%，0.83%，0.68%，表明进样精密度良好。
2.5 稳定性试验
取混合对照品溶液(甘草皂苷g2 48.16 μg/ml、甘草酸铵 105.76 μg/ml、乌拉尔甘草皂苷50.56 μg/ml)20 μl，分别在0、1、2、4、8、12、24、36 h进样，测得甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的峰面积rsd分别为0.97%、1.12%、1.01%，表明样品溶液在36 h内稳定。
2.6 重复性试验
配制同一产地(甘肃陇西)供试品溶液6份，分别进样测定，测得甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的含量平均值分别为1.21%、3.21%、1.28%，rsd分别为1.40%、0.89%、1.23%，表明重复性较好。
2.7 回收率试验
精密称取已知含量同批药材粉末6 份，每份约0.25 g，分别精密加入甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b对照品溶液适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，进样测定， 计算 回收率，结果甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的平均回收率分别为100.6%、100.8%、99.87%，rsd分别为1.9%、2.0%和1.7%(n=6)。结果见表1～3。表1 甘草皂苷g2回收率试验结果表2 甘草酸铵回收率试验结果表3 乌拉尔甘草皂苷b回收率试验结果
2.8 样品测定结果
精密吸取供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，重复3次，得甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b峰面积平均值，代入回归方程计算，求得不同产地甘草药材样品中甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的含量，结果见表4。
3 讨 论
3.1 流动相系统的选择 曾分别用水乙腈磷酸，乙腈1%醋酸溶液，乙腈2%醋酸溶液，甲醇0.2 mol/l乙酸铵水溶液冰乙酸，水(0. 01 mol/l乙酸) 乙腈等不同比列的几种流动相体系进行实验，结果表明甲醇0.2 mol/l乙酸铵水溶液冰乙酸(体积比65∶34∶1)溶剂系统分离效果较好，各峰的保留时间适中，样品分析时间在18 min内。
3.2 elsd检测器参数的设定 研究发现载气流速和漂移管的温度对elsd的检测性能有较大影响，在仪器规定的参数范围内经反复实验，最终确定elsd检测器的参数为雾化气体流速2.8 l/min，漂移管温度为110 ℃。
3.3 供试品溶液的制备 在样品处理过程中，曾比较了以水、不同比例的乙醇和甲醇、流动相为溶剂，回流提取、索氏提取和超声提取，结果表明以流动相为溶剂，超声提取，样品中甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b提取完全，且操作简便。
3.4 中国 药典(2005年版)采用hplc法测定甘草皂苷类成分中的甘草酸和甘草黄酮类成分中的甘草苷，以控制甘草的质量。本文采用hplc法测定甘草皂苷中的3种成分，可获得甘草皂苷类化学成分的更加明确的结果，可为更全面地控制甘草质量提供 科学 、有效的检测方法。
3.5 本研究表明，我国不同产地的甘草中均含有甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b，因产地不同，这3种皂苷的含量有较大差别，其中，以宁夏盐池产甘草药材中甘草皂苷g2、甘草酸铵、乌拉尔甘草皂苷b的含量最高。本实验结果具有简便、快速、重现性好的特点，可作为甘草药材质量控制的依据。
【 参考 文献 】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[m].北京:化学 工业 出版社,2005:59-60.
[2] 于辉,李春香,宫凌涛,等.甘草的药理作用概述[j]. 现代 生物医学进展,2006,6(4):77-79.
[3] 杨跃伦.甘草的临床应用浅析[j].
