作者：陈武，莫炜，张艳玲，宋钢，宋后燕
【摘要】 目的 研究人纤溶酶原 kringle 区缺失突变体(plgδk)的毕赤酵母(pichia pastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法 采用7.5 l发酵罐对工程菌 plgδk/gs115 进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、hplc、质谱分别检测 plgδk 等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物s2403 分别测定plgδk 激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。 结果 7.5 l高密度发酵可获得约为400 mg/l培液的表达量，经三步纯化后制备的plgδk纯度大于96%。理化分析显示plgδk的等电点为7.5～7.8，分子量：27. 787 kd，比活性：23.6 u/mg。 结论 初步建立了plgδk的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的plg相近，具备放大生产和应用的潜力。
【关键词】 毕赤酵母 kringle 区 纤溶酶原 缺失突变体 纯化
abstract:objective to investigate the expression,purification and characters of the kringle domain deletion mutant of human plasminogen(plgδk)in pichia pastoris.methods fermentation at high density (a600>200) in a 7.5 l fermenter was carried out and plgδk was purified from the culture broth in a three stepprocess: ultrafiltration,gel filtration,ion exchange chromatography,and was lyophilized after dialysis. the ife,hplc and lcms were used to detect its isoelectric point (ip),purity,and molecular weight (mw). the fibrinolytic activity and amidolytic activity were measured with fibrin plate and chromogenic peptide substrate s2403 respectively.results fermentation in 7.5 l scale yielded an expression level of approximately 400 mg plgδk per liter fermentation broth. through three steps of purification,the plgδk had a purity of over 96%. the exact mw of plgδk was 27.787 kd examined by lcms and its ip was 7.5-7.8.conclusion a pilot expression and purification technology of plgδk in pichia pastoris cultured at high density has been set up. the activities of intermediate production are comparable to that of plasminogen extracted from human plasma,indicating a good perspective in scale up and application.
key words:deletion mutant; kringle domain; pichia pastoris; plasminogen; purification
人纤溶酶原(plasminogen,plg)是人体纤溶系统的主要成分，在体内经纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,pa)激活后，转变为纤溶酶 (plasmin,plm)，不仅发挥溶栓作用，还参与体内一系列与蛋白水解有关的生理病理过程，如炎症、组织修复、排卵、肿瘤侵袭和转移等。wWW.11665.CoM长期以来，纤溶酶被认为是一种具有潜力的直接溶栓药物，但由于分子量大、结构复杂、富含糖链且易自身降解，采用大肠杆菌、哺乳动物细胞表达效率较低[1,2]，因此对plg进行结构改造是近年来研究的热点。本室宋钢等采用毕赤酵母表达了一种纤溶酶原kringle 区缺失突变体(plgδk)，经激活后，具有较好的纤溶活性[3]。本实验在此基础上，深入研究了高密度发酵和纯化工艺，使其更适合大规模制备，并对其理化性质进行研究，为纤溶酶的开发利用提供了实验基础。
1 实验材料
毕赤酵母表达菌plgδk/gs115由实验室自行构建;纤溶酶、纤溶酶原、三肽化合物s2403 (l焦谷氨酰l苯丙氨酰l赖氨酸对硝基苯胺)购自sigma公司;ynb、酵母提取物购自difco公司;其余试剂均为国产分析纯;sephacryl s100 hr、superdex 75、 spsepharose ff(美国amersham pharmacia公司);3 kd、50 kd超滤膜(millipore pellicon);proflux m12超滤仪(millipore);bioflo 3000型7.5 l发酵罐及c25kc型温控摇床(美国nbs公司)。
2 方 法
2.1 plgδk表达菌7.5 l罐批发酵
采用nbs 7.5 l发酵罐高密度发酵，发酵条件控制：温度29.5 ℃ (pid模式)，ph5.1 (pid模式)，溶氧(35.0±5.0)% (agit模式)，搅拌300～700 r/min (d.o.模式)。
甘油补加：初始速率为0.6 ml·l-1·h-1，2 h内逐渐升高至9 ml·l-1·h-1，此后维持此速率，待a600达到150左右，停止补加甘油。
甲醇诱导：初始速率为1 ml·l-1·h-1，8 h内逐渐升高至12 ml·l-1·h-1，以后维持此速度，并根据溶氧值和ph值的变化，调整补加甲醇的速率，直至诱导20 h。
2.2 plgδk的分离纯化
发酵液以8 000 r/min,4 ℃离心 30 min，上清用截留分子量50 kd超滤膜除去残留菌体及沉淀，再以截留分子量3 kd超滤膜浓缩至原体积的1/10。
将浓缩液进行sephacryl 100凝胶过滤层析 (层析柱100 cm×7.5 cm)，用0.025 mol/l枸橼酸缓冲液(ph 6.0)洗脱，按吸收峰收集各组分，检测活性、sdspage分析，合并活性组分再进行spsepharose ff层析 ( 层析柱20 cm×5 cm)。先将spsepharose ff层析柱用a液 (ph 6.0,0.025 mol/l枸酸缓冲液 ) 平衡，将上述凝胶过滤后合并液1 l上样，先以a液洗脱，至第一峰止，再以a液与b液(ph 6.0,0.025 mol/l枸橼酸缓冲液+1 mol/l nacl)进行线形梯度洗脱，按吸收峰收集各组分，检测活性、sdspage分析，合并活性组分、透析除盐、加赋形剂甘露醇(终浓度3%)，以0.22 μm的膜滤过除菌，分装、冻干，4 ℃冰箱保存。以上分离纯化过程采用amersham pharmacia 层析系统在4 ℃冷房中进行。
2.3 plgδk的鉴定
2.3.1 plgδk的纯度鉴定 冻干的蛋白样品复溶后稀释为1 mg/ml，色谱柱为c18300a(2.1 cm × 10 cm，3.5 μm )。色谱分离条件：流动相a(95% 水，5% 乙腈，0.05% tfa)，流动相b(5% 水，95% 乙腈，0.05% tfa)，30 min内a相由100%降到0%，b相由0%升高到100%，流速0.2 ml/min，样品室温度10 ℃，柱温20 ℃。
2.3.2 plgδk分子量的测定 采用lcms测定plgδk分子量。lc方法同上，质谱检测条件：质谱源电压3.5 kv，毛细管电压28 v，质谱质量数范围800～2000。
2.3.3 plgδk的等电点的测定 采用固相ph梯度预制聚丙烯酰胺凝胶(t=5%，c=3%，ph 3～10，110 mm × 110 mm × 1 mm)，水平电泳的等电聚焦方法测定样品的等电点。电泳条件：100 v，15 min; 200 v， 15 min; 400 v， 60 min。至电流读数为0 ma。冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0 mg/ml，每孔上样 5 μl，考马斯亮蓝r250染色。
2.4 plgδk的酶学性质
2.4.1 纤维蛋白板法测定plgδk比活性 1% 琼脂糖凝胶板中含有0.05 mol/l ph 7.4 pbs、1.5% 纤维蛋白、800 u/ml尿激酶、0.02% nan3。凝胶打孔后，各孔中加等体积的样品液或plg标准品，37 ℃湿盒保温过夜。游标卡尺测定各孔溶圈直径，以溶圈直径的对数与标准品活性作标准曲线，计算样品的比活性。
2.4.2 tpa激活plgδk和plg 分析 分别将plgδk和plg干粉以适量0.02 mol/l ph 7.4 pbs溶解，并分别以200∶1摩尔比与组织型纤溶酶原激活剂 (tpa) 进行混合，37 ℃ 水浴激活，每10分钟间隔取样50 μl，还原性 sdspage分析。同时通过底物 s2403进行活性测定[4]，并以等摩尔浓度纤溶酶 (sigma,missouri,usa) 为标准，每个样本重复测定5次。
3 结 果
3.1 发酵过程菌密度及比活性测定
由图1可见，甲醇诱导后，酵母生长速率明显减缓。至发酵结束时，a600约为280左右。sdspage显示诱导后4 h，32 kd处出现清晰条带，并随诱导时间逐渐加深，其培液可在纤维蛋白板上形成明显溶圈。至20 h时plgδk表达进入平台期，通过光密度扫描分析显示plgδk表达量约占培液蛋白总量的32%，纤维蛋白板测定比活性为4.8 u/ml。
3.2 发酵液plgδk的纯化
经超滤、sepharcryl s100、sepharosesp ff后，所得plgδk半成品纯度达96%以上，每升培养液获得plgδk约200 mg，比活性为23.6 u/mg，纯化过程分析见表1。
表1 发酵液plgδk纯化过程的分析
3.3 纯度鉴定及分子量、等电点测定
hplc测定半成品的纯度大于96%;lcms测定plgδk的分子量为27.787 kd;等电聚焦测定plgδk等电点为7.5～7.8(图2)。
3.4 tpa 激活plgδk和plg分析
还原性sdspage后凝胶光密度扫描可见：37 ℃激活40 min时，80%以上的plgδk和plg被激活。plgδk激活后显示26 kd和5 kd两个条带(图3a);而plg激活后产生plm，由于部分自身降解，因此显示66 kd、26 kd和11 kd的3个条带(图3b)。以三肽底物s2403进行活性测定，证明激活后的plgδk和plg均具有水解s2403活性，与相同摩尔浓度的纤溶酶相比，37 ℃ 40 min所产生的水解活性皆在80%以上 (n=5)(图3c)。
4 讨 论
人plg是由多个结构域组成的糖蛋白，包括n端多肽(ntp)、5个同源的kringle区(k1-k5)、丝氨酸蛋白酶区(sp)。pa特异性水解plg arg561val562,形成由二硫键维系的双链活性纤溶酶。在碱性条件下(ph 11.0)，纤溶酶可水解plg arg530lys531，产生由5个kringle区组成的重链和由sp组成的轻链lys531asn791，后者称为微小纤溶酶原，经pa激活后具有纤溶活性[4]。本室沈俊卿等构建了一种由phe546asn791组成的plgδk，并通过e coli.获得了表达，但由于大肠杆菌作为原核生物，不具备蛋白质翻译后加工能力，蛋白复性成为关键问题。plgδk具有6对二硫键，复性十分困难，虽经努力，复性后显示出纤溶活性，但活性很低[5]。宋钢[3]等采用酵母表达，获得高活性的plgδk。j wang 等采用杆状病毒/昆虫细胞表达plg pro544asn791，产物同样具有较高活性，但表达量仅为3～12 mg/l培液，不能满足大规模生产的要求[6]。
pichia pastoris表达系统是近年来发展起来的极具潜力的酵母表达系统，既具有真核生物蛋白翻译后加工的能力，又具有原核生物易于培养、繁殖快、操作简便的特点，通过分泌性载体可将目的蛋白释放到培液中，方便下游的分离纯化;而且酵母可以在高密度下生长良好，据报道在合适的培养条件下，酵母菌密度a600可达到1 000以上，外源蛋白表达量可达5 g/l培液。本实验采用7.5 l发酵罐进行高密度培养，至发酵结束时a600约为280，每升培液的表达量约为400 mg，比摇瓶培养提高了10倍左右。
由于巴斯德壁赤酵母没有稳定的附加体质粒，所以外源基因需整合入酵母染色体中，整合方式包括同源双交换引起的基因置换和位点特异性单交换引起的基因插入。前者使宿主的aox1结构基因被外源基因表达盒所替换，因而使宿主失去大部分甲醇利用能力，在甲醇培养基中生长缓慢，即muts (methanol utilization slow)表型：后者则并未破坏宿主的aox1结构基因，利用甲醇能力强，即mut+ (methanol utilization plus) 表型。本实验所用工程菌的aox1基因被plgδk基因取代，表现为甲醇利用缓慢，在甲醇诱导后，菌体生长速度明显减缓。此外，过高的甲醇会对muts酵母产生明显的毒性作用，影响外源蛋白的表达。因此，优化甲醇补加速率可进一步提高plgδk表达水平。
此外，由于自然界中广泛存在pa，如葡激酶、链激酶、凝血酶等，易激活表达的plgδk发生自身降解，以及酵母本身存在的蛋白酶，均会导致plgδk表达、分泌、纯化过程中出现降解。因此，本实验在诱导培养时加入1%的酪蛋白水解物，提供给蛋白酶足够的底物，有效地降低了酵母蛋白水解酶及plgδk的自身降解作用。当然，也可以通过降低培液的ph值、突变或缺失酵母宿主主要蛋白酶基因等方法提高外源表达蛋白在酵母菌中的稳定性。
总之，本实验初步建立了plgδk pichia pastoris工程菌高密度发酵、产物纯化工艺，并对制备的plgδk半成品进行了理化鉴定，为大规模生产提供了实验基础。目前，人plm及其突变体已用于多种疾病的治疗研究，如心、脑血管梗死、深静脉血栓形成以及阿茨海默氏病和多种眼科疾病等[7]，且与某些同类药物相比具有无免疫原性、低毒副作用、效率高等优点[8]，因此加强plg生产工艺以及结构与功能的研究具有重要意义。
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