【摘要】 目的 探讨肝纤溶颗粒抗肝纤维化的分子机制，为防治肝纤维化的中药制剂提供理论基础。方法 以四氯化碳（ccl4）高脂低蛋白乙醇复合因素诱导的肝纤维化模型大鼠为研究对象，观察肝纤溶颗粒（由黄芪、当归、三七、桑椹子、龟板胶、阿胶组成）对模型大鼠的影响。应用免疫组织化学方法检测肝组织中血小板衍生生长因子bb（pdgfbb）表达。结果 随着剂量的升高，肝纤溶颗粒可明显降低大鼠pdgfbb表达，并且与阳性对照组比较无显著性差异(p>0.05)，与模型组比较有显著性及极显著性差异。结论 肝纤溶颗粒能明显降低肝组织pdgfbb表达，这可能是肝纤溶颗粒防治肝纤维化发生机制之一。
【关键词】 肝纤维化；免疫组化；pdgfbb；肝纤溶颗粒
肝纤维化是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础，其形成与发展已经成为影响诸多肝病预后、转归的关键。因此，有效地阻断肝纤维化的发生发展对防治肝硬化具有重要意义。肝纤溶颗粒（由黄芪、当归、三七、桑椹子、龟板胶、阿胶组成）在我院应用于临床防治肝纤维化已多年。本文以四氯化碳（ccl4）高脂低蛋白乙醇复合因素诱导的肝纤维化模型大鼠为研究对象，观察肝纤溶颗粒对模型大鼠的影响，应用免疫组织化学方法检测肝组织中的血小板衍生生长因子bb（pdgfbb），探讨肝纤溶颗粒抗肝纤维化的分子机制，为防治肝纤维化的中药制剂提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 健康雄性wistar大鼠66只，体重(220±20) g，由吉林大学实验动物中心提供。wWW.11665.coM超敏链霉素抗生素蛋白过氧化物酶染色法(ultra sensitive sp)试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司,一抗购自武汉博士德生物工程公司。肝纤溶颗粒(长春中医药大学附属医院制剂室)，扶正化瘀胶囊(上海黄海制药有限责任公司)，40% ccl4色拉油溶液，胆固醇分析纯，高脂低蛋白复合饲料及酒精饮料。
1.2 方法 66只大鼠随机分为6组：模型组（16只），（肝纤溶颗粒）低剂量组（10只），中剂量组（10只），高剂量组（10只），（扶正化瘀胶囊）阳性对照组（10只），正常对照组（10只）。大鼠除正常对照组外，其余5组同时复制模型。予高脂低蛋白复合饲料饲养，同时用乙醇饮料在1 w内由2％逐渐增加到10％浓度喂养，连续4 w，继以0.2 ml/100 g体重40% ccl4色拉油溶液用量每周2次，注射2 w。以后2 w继续喂养高脂低蛋白复合饲料及酒精饮料。4 w后除正常组和模型组外，其他组开始分别给予低、中、高剂量的肝纤溶颗粒及扶正化瘀胶囊灌胃给药。正常对照组皮下注射等量生理盐水，每周注射2次，正常饲养。实验全部结束时，于肝左叶同一部位取肝组织迅速投入液氮，之后转入-70℃冰箱保存，备肝组织匀浆抽提10％的组织rna。免疫组化按照试剂盒进行检测，将各组石蜡切片常规脱蜡至水；柠檬酸修复液进行抗原修复；磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液冲洗3 min×3次，滴加阻断剂15 min；pbs缓冲液冲洗3 min×3次，滴加血清20 min；滴加浓度为1∶200的一氧化氮合酶（enos）ⅰ抗，4℃过夜；pbs缓冲液冲洗5 min×3次，滴加ⅱ抗；pbs缓冲液冲洗3 min×3次，滴加ⅲ抗；pbs缓冲液冲洗3 min×3次，二氨基联苯胺（dab）显色3～5 min；切片放入自来水中充分水洗；苏木精复染；常规脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。结果将免疫组化切片置olympus显微镜下，采用免疫组化反应显色强度jeda801d形态学图像分析系统，取每张切片的均值作为该例的测量值〔1〕。
1.3 统计学方法 实验数据均以x±s来表示，运用spss13.0软件进行计算，组间比较采用方差分析。
2 结果
pdgfbb棕色颗粒位于阳性细胞的胞浆及胞膜内，正常对照组pdgfbb 主要在动静脉血管内呈轻微表达，弱表达于汇管区基质及间质细胞。模型组pdgfbb的阳性颗粒明显增多，在汇管区、间隔内细胞、炎细胞浸润聚集区、窦旁细胞内均有表达。pdgfbb分布与单核巨噬细胞、肝星型细胞及胶原沉积部位相一致。各给药组中pdgfbb表达明显减少，主要见于血窦旁、汇管区。免疫组化统计结果表明，随着剂量的升高，肝纤溶颗粒可明显降低大鼠pdgfbb表达，并且与阳性对照组比较无显著差异(p>0.05)，与模型组比较有显著性及极显著性差异。见表1。
表1 大鼠治疗后肝脏pdgfbb蛋白表达的比较（略）
与模型组比较：1）p<0.05，2）p<0.01；与正常对照组比较：3）p<0.05，4）p<0.01；与阳性对照组比较：5）p<0.05，6）p<0.01
3 讨论
肝纤维化的形成是一个有多种细胞因子参与的复杂过程，其中pdgf被认为是刺激肝星状细胞（hsc）增殖最为有效的有丝分裂因子，对hsc的活化、分裂、增殖及其合成胶原等均有明显的促进作用。肝纤维化过程中过度表达的pdgf起着重要的作用，如果对pdgf转录、翻译以及翻译后修饰等过程中的任意一个环节实行调控，可有利于肝纤维化的治疗。但目前临床上还没有基于pdgf而采取的抗肝纤维化的治疗，仅限于一些实验研究。肝纤溶颗粒是以“益气养血，活血化瘀”为治法的纯中药制剂，由黄芪、三七、龟板胶、阿胶、桑椹子、当归等药物，经现代制药工艺加工合成，经应用于临床治疗瘀血阻络证之慢性肝病肝纤维化指标异常者，证明其具有明显的保肝降酶和抗肝纤维化作用。本实验结果显示，通过免疫组化法测pdgfbb表达，肝纤溶颗粒各治疗组及阳性对照组的表达均明显下降，因此肝纤溶颗粒可能具有pdgfr抑制剂的抗肝纤维化作用。这可能是肝纤溶颗粒防治肝纤维化发生机制之一。
【参考文献】
1 孙敬方.动物实验方法学〔m〕.北京：人民卫生出版社，2001：4745.
(编辑 袁左鸣)
