作者：戴帆，董斌，郭晓磊，石碧珠，方丽娟，莫家琳，田素娟，孟民杰
【摘要】 目的 研究人工合成的cpg odn对乙肝表面抗原的免疫增强效应，评价cpg odn的佐剂效应。方法 将不同剂量特定的cpg odn与乙肝表面抗原联合免疫小鼠，用elisa检测小鼠乙肝表面抗体的滴度。结果 cpg odn联合乙肝表面抗原免疫小鼠，在短期检测中，高剂量组能较快的达到检测阈，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(p<0.05)，在长期检测中，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(p<0.05)，检测值随cpg剂量的增高而增大。结论 cpg odn增强乙肝表面抗原的免疫反应短期和长期都具有剂量效应。
【关键词】 cpg odn 乙肝表面抗原 免疫佐剂 体液免疫
abstract:objective to investigate the effects of immunological enhancement of hbsag with synthetic cpg oligodeoxynucleotides,evaluate the adjuvant effect of cpg odn. methods mice were vaccinated with cpg oligodeoxynucledtides and hbsag at different doses,and then titers of hbsab in the blood serums of mice were detected with elisa. results cpg odn and hbsag immunize the balb/c mice,the highdose group could be detected quickly in shot term,the levels of antibodies in groups which use different doses of cpg odn and hbsag were different in statics(p<0.05),in long term the levels of antibodies in groups which use different doses of cpg odn and hbsag were different in statics(p<0.05),the levels of antibodies were corresponded with the levels of cpg odn (p<0.05).conclusion the immunological effect of hbsag was enhanced with cpg odn as adjuvant in short and long terms.
key words:cpg odn; hbsag; immunoadjuvant; humoral immunity
cpg基序是一种具有非特异性免疫刺激能力的dna序列，为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列。WwW.11665.cOmcpg odn (unmethylated cpg motifbased oligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化cpg基序的寡核苷酸序列。cpg odn可刺激人类和多种动物产生自然免疫和获得性免疫，主要通过tlr9信号系统活化免疫系统，最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖，包括b淋巴细胞、t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞和dc细胞。cpg odn能快速活化t、b细胞，诱导th1型免疫反应并能促进抗原递呈细胞的增生和成熟[1]。现阶段我国对乙型肝炎的预防主要是通过注射乙型肝炎疫苗，但接种免疫过程中和接种免疫后会出现免疫较弱和不免疫现象[2,3]。所以，选择一种安全有效的免疫佐剂是增强免疫效果的有效途径。本文通过测定不同时间段的小鼠注射cpg odn和乙肝表面抗原后的抗体滴度，评价cpg odn作为免疫佐剂增强乙肝疫苗的免疫效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 bal b/c小鼠，雄性，6周龄，体质量18～22 g，spf级，购自中山大学实验动物中心，许可证号：scxk(粤)20040011。
1.1.2 试剂 血源性乙肝表面抗原购自上海前尘生物，cpg odn 由本实验室保存。
1.2 动物分组及免疫方案
1.2.1 动物分组 50只bal b/c小鼠根据随机分配表，随机平均分成5组：第1组为hbsag和高剂量cpgodn联合免疫组，第2组为hbsag和中剂量cpgodn联合免疫组，第3组hbsag和低剂量cpgodn联合免疫组，第4组为hbsag单用组，第5组为生理盐水对照组。各组饲养条件相同。
1.2.2 动物免疫 分别于第0、2、4周免疫bal b/c小鼠，每次免疫剂量相同。第1组：尾静脉注射含2 μg hbsag 和100 μg cpgodn生理盐水溶液，100 μl/只;第2组：尾静脉注射含2 μg hbsag 和1 μg cpgodn生理盐水溶液，100 μl/只;第3组：尾静脉注射含2 μg hbsag 和10 ng cpgodn生理盐水溶液，100 μl/只;第4组：尾静脉注射含2 μg hbsag生理盐水溶液，100 μl/只;第5组：100 μl生理盐水/只。
1.3 乙肝表面抗原检测
1.3.1 血清采集 断尾后玻璃毛细管采血，室温自然凝固，常温离心后取上清，-20 ℃保存。
1.3.2 抗原检测 96孔板用碳酸氢钠缓冲液(15 mmol/lna2co3，355 mmol/lnahco3，ph 9.6)适当稀释的乙肝表面抗原包被，4 ℃过夜孵育。用含tween20的pbs(0.1 mol/lpbs,0.1% tween20)洗涤3次，每次间隔3 min，每孔加入100 μl经pbs(0.1 mol/l pbs,1% bsa)适当稀释的待测血清， 37 ℃孵育90 min。 pbs洗涤5次， 每孔加入100 μl
1 000倍稀释的hrp标记的乙肝表面抗原，37℃孵育40 min。pbs洗涤5次，每孔加入100 μl tmb底物(含0.1 mg/ml 3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，ph 5.4，用前加5 ml 30% h2o2 10 ml)，37 ℃孵育1 h。每孔加入100 μl h2so2(0.2 mol/l)终止显色反应。biorad 680 测定a450/630读数。
1.4 统计学分析
应用spss统计软件，采用重复测量方差分析对数据进行分析，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 小鼠免疫后7～28 d外周血中乙肝表面抗体的平均滴度变化
乙肝表面抗原单用组的抗体在7～17 d时间段内检测不到，乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫的抗体在第14天检测到，乙肝表面抗原和中剂量cpg odn联合免疫组的抗体在第10天检测到，乙肝表面抗原和高剂量cpg odn联合免疫的抗体出现时间较早，在第7天即可检测到。在第14～28天的各个时间点上，乙肝表面抗原和高剂量cpg odn联合免疫组的抗体滴度均显著高于乙肝表面抗原和中剂量cpg odn联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫组(p<0.05);在第14、17、21天时间点上，乙肝表面抗原和中剂量cpg odn联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫组之间差异无显著性(p<0.05)，在第24、28天时间点上，两组差异有显著性 (p<0.05);在第21、24、28天时间点上，乙肝表面抗原和中剂量cpg odn联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫组的抗体滴度均显著高于乙肝表面抗原单用组(p<0.05)。见图1和表1。表1 免疫7～28 d hbsab滴度对数转换数据
2.2 小鼠免疫后3～8周外周血中乙肝表面抗体的平均滴度变化
在第3～8周时间内，第4周乙肝表面抗原和高剂量cpg odn联合免疫组、疫苗和中剂量cpg odn联合免疫组之间的抗体滴度差异有显著性(p<0.05);在其他时间点上，乙肝表面抗原和高剂量cpg odn联合免疫组的抗体滴度与其他组别差异均有非常显著性(p<0.01)，并持续快速升高。乙肝表面抗原和中剂量cpg odn联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫组的抗体滴度从第3周之后均逐渐升高，在第3、4、5、6周时间点上，只有第4周两组之间差异有显著性 (p<0.05)，其他时间点差异均无显著性 (p<0.05);到第7、8周时两组差异有显著性(p<0.05)。对于乙肝表面抗原单用组，虽然抗体滴度有逐渐升高的趋势，但却一直处于比较低的水平，除了第4周与乙肝表面抗原和低剂量cpg odn联合免疫组之间的抗体滴度差异无显著性外(p>0.05)，其他时间点上与其他各组差异均有显著性(p<0.05)。见图2和表2。表2 免疫3～8周hbsab滴度对数转换数据
3 讨 论
对于cpg odn的免疫刺激作用人们已经进行了大量的研究。在应用方面，人们较为关注其安全、有效的佐剂特性。因为cpg odn能同时增强抗原特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，尤其对细胞免疫应答具有更突出的增强作用[4]。本实验发现,应用cpg odn作为乙肝表面抗原的佐剂，能较早较快地刺激机体产生乙肝表面抗体，cpg odn作为佐剂使用增强乙肝表面抗原的免疫效应，cpg odn的使用量在实验的剂量范围内具有一定的剂量效应关系，高剂量的cpg odn的使用对增强乙肝表面抗原的免疫效应效果更早更好。由实验数据观察来看，单纯的乙肝表面抗原抗原性是较弱的，搭配佐剂使用，才能有效地提高乙肝表面抗原的免疫原性[5]，提高乙肝表面抗原的免疫效果。实验剂量范围内，增强乙肝疫苗抗原抗体反应是显著的，并且动物也无逆毛、腹泻、发热或其他中毒现象等任何异常，表明cpg odn的使用是安全可靠的。
cpg odn的作用是通过有toll样受体家族的细胞，主要是tlr9受体识别cpg的基序，从而通过若干信号传递途径活化转录因子，启动相关细胞因子的基因转录[6]。本实验所用的cpg odn是将60 bp磷酸二脂修饰的odn与puc18载体体外连接构建的重组质粒puc18odns，更真实地模拟了天然的包含cpg基序的非甲基化的odn。在免疫过程中，cpg odn以模拟细菌感染的方式激活了细胞经由tlr9通道的固有免疫[6]，由于cpg odn仅仅是一段dna序列，在激活免疫的同时不具有感染性，小鼠未发生任何炎性反应[7,8]。同时，cpg odn激活了体内的免疫细胞，调动了免疫系统，使乙肝疫苗能够较早较快的产生免疫反应[7,8]。由于cpg odn的免疫刺激作用，小鼠的机体可以较长时间的处于免疫活化状态，免疫细胞免疫活性高，乙肝表面抗体得以长期高水平的经由b细胞分泌[7,8]。在有的实验中，大量的细菌dna产生抗双链dna的自身抗体，加重小鼠的自身免疫性疾病;在本实验中使用cpg odn，乙肝表面抗体产生早，滴度高，持续久，并且安全可靠。在应用cpg odn作为乙肝疫苗佐剂的临床试验中，首次和第2次免疫后抗体水平甚至可以提高13～45倍[9];同时，由于cpg对cd8+t细胞刺激作用，诱导的ctl细胞在细胞免疫作用杀伤肿瘤以及治疗胞内感染也具有很好的应用前景[10]。但是对长期性观察的缺失，还不能够全面反映cpg odn的作用效果，长期效应的机制也未被揭开。
本研究结果表明，本实验室制备的cpg odn作为乙肝表面抗原的佐剂能较早较快地促进乙肝表面抗原的抗原抗体反应，并且安全可靠。在长期效应上，cpg odn作为佐剂对维持乙肝表面抗体的有效滴度具有长期效应。
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