作者：贝伟剑，李楚源，王德勤，胡德辉，彭文烈，徐安龙
【摘要】 目的 研究脑心清及其黄酮成分对海马神经元细胞l型ca2+通道活性的影响。 方法 采用全细胞记录式(wholecell model)的膜片钳技术记录海马神经细胞l型ca2+通道电流变化。 结果 槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%，可使ica,l 的i-v相关曲线下移，但没有电压依赖性特征，也不改变钙通道的电学特征。结论 脑心清及其黄酮成分对海马神经细胞l型ca2+通道活性有激活增强作用，有利于神经元细胞内钙稳定，发挥抗缺血再灌注损伤的作用。
【关键词】 l 型ca2+通道 脑心清 黄酮 槲皮素 海马神经元 膜片钳技术
abstract:objective to investigate the effects of quercetin,fldkp70 and naoxingqing (nxq) on ltype calcium channel (ltcc) in the cultured pyramidal neurons isolated from hippocampus.methods calcium currents were recorded in wholecell patchclamp mode with quercetin,fldkp70 and nxq in the measurement medium.results it was found that 5.0～25.0 μg/ml of quercetin,fldkp70 and nxq enhanced ltype calcium channel current by 61.6%,55.3%,52.0% ，respectively in the cultured neurons. significantly,the quercetin,fldkp70 and nxqmediated increases of calcium currents saturated at the concentrations around 100 μg/ml in the cultured neurons.conclusion these findings suggested that the ltype calcium channel in cultured pyramidal neurons could be modulated by quercetin,fldkp70 and nxq,which might be beneficial to the intracellular calcium homeostasis in the insulted and damaged susceptible neurons under ischemia/reperfusion disorder.
key words:ltype ca2+ channels; hipocamcal pyramidal neurons; naoxinqing (nxq);flavonoids;quercetin;patchclamp
在复杂的编码细胞内激活细胞凋亡的信号相互作用中，钙起着重要作用。WWW.11665.coM通过内质网、线粒体和其他信号通路，ca2+稳态改变与启动细胞凋亡性死亡密切相关[1，2]。ca2+稳态的调节极其复杂，至今还未明了。近年来研究表明，在控制ca2+稳态的过程中更精细的变化可能对决定细胞生死有深刻影响[3]。ca2+稳态可能是凋亡的基本致病过程中的一个药理靶标。
l型ca2+通道在海马锥体神经元基底树突和胞体都特别集中，其电流占细胞总钙电流的30%～50%。它们的开放和关闭能有效调节细胞浆内ca2+的水平，而且有证据表明它们还能将钙信号直接传至细胞核[3，4]。l型ca2+通道的激活可以直接调控一些对神经元存活及其功能所必需的重要基因的表达，如bcl2和脑源性神经营养因子等[5]。
脑心清(nxq)及其有效成分柿叶黄酮(fldk)都具有抗脑缺血损伤作用[6],通过上调抗氧化基因bcl2的表达，改善神经细胞氧化还原状态，清除自由基、抗脂质过氧化等方面来发挥其抗缺氧缺血性神经损伤、抗氧化应激和抗兴奋性谷氨酸毒性神经损伤、抗急性脑缺血作用，抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，保护缺血再灌注引起损伤的脑组织，并能改善缺血再灌注引起损伤的脑组织神经功能[6，7]。本文研究脑心清及其黄酮成分对海马锥体神经元l型ca2+通道活性的影响，以探讨在ca2+稳态调节方面，脑心清及其黄酮成分抗脑缺血损伤神经保护作用的机制。
1 实验材料
1.1 受试药
脑心清片用干浸膏(以下简称脑心清、nxq)，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。
脑心清黄酮(fldk)，由脑心清经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量77.35%，其中槲皮素类含量34.625%，山柰酚类含量为42.50%(hplc测定),代号fldkp70。用2% nahco3 溶液加热到80 ℃溶解成含药25 mg/ml的热溶液。
实验所用溶液的ph均用hcl 和naoh溶液调至7.2～7.4,并用0.22 μm的滤膜过滤除去尘粒和细菌。室温保存，用时加pbs稀释至所需浓度即可。
1.2 药品与试剂
阿拉伯糖胞嘧啶、dna酶ⅰ、2巯基乙醇、mem(modified eagle medium)合成培养基、dhanks 平衡盐干粉、dmem培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、l谷氨酰胺、多聚赖氨酸(mw70150kd)均为美国hyclone公司产品。rnase a(sigma):以1 mg/ml的水溶液,经100 ℃煮沸以灭活dna酶活性后,分装冻存于-20 ℃备用。
1.3 大鼠
新生sd乳鼠,24 h龄，体质量约5.5～10 g，清洁级，合格证号：粤检证字第2003a053号，南方医科大学实验动物中心提供。
1.4 主要仪器
leica dmlfs倒置显微镜、mo203微电极操纵器(mo203，日本)、axopatch 200b型膜片钳放大器(美国 axon instrument)。
2 实验方法
2.1 新生乳鼠海马神经元的原代培养[4]
无菌条件下，借助于解剖显微镜，取刚出生24 h内的sd乳鼠，分离海马组织，用0.25%胰蛋白酶和0.2%脱氧核糖核酸酶pbs溶液37 ℃孵育消化20 min,并不断摇动,用3倍体积的dmem培养基分散和冲洗,消化的细胞经200目细胞筛过滤后，200×g离心5 min,用血球计数板计数细胞,0. 4%台盼蓝镜检存活率大于95%，以1.5 × 105个/ml的密度种植于涂有多聚赖氨酸(10 μg/ml)的24孔培养皿内,每孔0.4 ml,完全培养基为45% dmem+45% f12+10%胎牛血清的混合液,内含青霉素(100 iu/ml)和链霉素100 μg/ml。正常糖培养液： 含5 mmol/l葡萄糖的完全培养基。在一定湿度的37 ℃恒温的培养箱(5%co2)培养48 h，换培养基去除死细胞，加入终质量浓度为10 μg/ml的阿糖胞苷培养48 h，抑制非神经元细胞生长。然后隔48 h换半量新培养基，继续培养12 d，进行钙通道活性测定。
2.2 膜片钳技术测定海马神经细胞l型ca2+通道电流[8]
2.2.1 l型钙通道全细胞钙电流记录的液体配制 细胞浴液(mmol/l)：choline chloride 75; teacl(氯化四乙铵，tetraethyl ammonium tea)50;bacl2 5; cscl 5;hepes 10; mgcl2·6h2o 2;dglucose 10;ttx(河豚毒素，tetrodotoxin) 0.001。用teacl调ph 至7.3。电极冲灌液(mmol/l)：csmeth 145; teacl 10; egta 10;mgcl2·6h2o 5;hepes 10; cacl2·2h2o 1;mgatp 5;leupitin 0.1;用csoh调ph 至7.3，过滤除菌，避光保存。
2.2.2 记录用玻璃微电极的制作 用无芯硬质玻璃毛细管坯(gg15，中科院上海生理所)在垂直微电极拉制仪(p97拉制器)上用两步法拉制。在其尖端涂布ntrimethylsilydiethylamine，并进行热抛光。电极尖端直径约为1 μm，内灌电极液后，全细胞记录的电极冲灌电极液后入细胞浴液的电极电阻在2～5 mω为佳;内插泛极化氯化银与膜片钳放大器探头相连。
2.2.3 全细胞式膜片钳记录[10] 将载有海马神经元的载玻片从培养板中取出,在每次实验前均用记录浴槽内的溶液冲洗带有神经细胞的载玻片，以洗去细胞表面上的其他成分，然后置于含有培养液的膜片钳测定专用平台液槽中，加1 ml浴液，实验仅选用状态优良的锥体细胞(贴壁良好、有明显突起、细胞边界清昕、胞浆均匀一致)。
在显微镜下找到优良的单个神经元细胞，通过倒置显微镜和微电极操纵器监视，驱动微电极接近细胞。当微电极尖端刚刚接触到细胞时，稍加负压，使之与细胞膜形成高达10 gω以上的高阻密封即刻形成。
在贴附式基础上，实验中仅选用密封电阻大于5 gω的细胞。再施以负压吸破细胞膜，形成全细胞记录状态,根据需要对串联电阻和电容进行补偿，再进行记录即为全细胞记录[10]。用l型钙通道特异性阻断剂硝苯地平(nifedipine)和开通剂bay k 8644鉴定所记录的电流为l型钙通道电流。前置放大器的低通滤波设置 1 khz。用 axopatch 200b型膜片钳放大器，调用pclamp软件的clampex程序，由此发出去极化脉冲波，同步采集通道开放电流，一次采集50条曲线存入硬盘。记录时，钳制电压-40 mv施予150 ms,0 mv去极化脉冲，记录ica,l。并给予-70～60 mv的系列去极化脉冲，去极化步距为10 mv，记录钙电流，以各电流幅值对相应电位作图得i-v相关曲线。
2.3 实验分组与药物处理
药物以高浓度溶解在电极液中，实验时加5～20 μl到神经细胞孵育液中，使达到所需浓度。分组：①正常对照：给予溶媒对照。②给药组: 脑心清、fldkp70 、槲皮素、芦丁，剂量分别为5.0、10.0、20.0 μg/ml。
测定记录正常和给药条件下的海马神经细胞l型ca2+通道活性的有关参数，记录在电脑软件上。实验在(25±1)℃温度下进行。
2.4 资料分析
全细胞记录的结果可用clampfit软件直接分析。
2.5 统计学处理
数据以(±s)表示,采用非配对t检验，p<0.05为差异有显著性。patch数用n表示。
3 结 果
3.1 海马锥体神经细胞全细胞l型钙通道电流特性
正常海马锥体神经细胞l型钙通道多显短暂性开放,在记录时间里,无明显的通道时间依赖性失活;当钳制电压vp为-40 mv时,可见一定的内向电流。不同钳制电压下，有不同的电流值,能被bay k 86444激活，并且被硝苯地平完全抑制。当vp=-10 mv时，l型钙通道电流ica,l峰值,电流幅度平均值为(-192.7±46.2)pa，见图1、表1。
3.2 脑心清及其黄酮对海马神经元全细胞l型钙通道电流幅度的影响
脑心清及其黄酮fldkp70 、槲皮素对海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流幅度的影响见表1、图1-3。表1 脑心清、柿叶黄酮和槲皮素对大鼠海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流的影响注:*vp=-10 mv时，药物处理各组ica,l峰值(电流幅度平均值);与对照组比较:*p<0.05;**p<0.01
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，并呈浓度依赖性增加，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%,可使ica,l的iv相关曲线下移，在不同钳制电压下电流幅度均有增加，但没有电压依赖性特征(不改变i-v相关曲线的形状)，也不改变钙通道的电学特征(最大激活电位在10 mv附近也未改变)，见图1-3和表1。提示它们对海马锥体神经细胞l型钙通道有激活增强作用，并且这种激活是在钙通道结构和功能没有受到破坏的情况下激活。
对海马锥体神经元全细胞l型钙通道电流最大幅度增强作用的强度从大到小顺序为槲皮素>柿叶黄酮>脑心清。
4 讨 论
中枢神经系统神经元上存在l、n、p、q、r、t等6种类型的电压依赖型钙通道,它们各自有不同的电生理学特征[3]。本实验由于细胞外液中的ttx选择性地阻断了钠通道，外液中的tea和电极内液中的cs+选择性地阻断了钾通道，所记录到内向电流为钙电流。其开放动力学特征与文献报道高电位激活电压门控性钙通道有相似的电学特征性[3]，是典型的l型钙通道。
近年来，传统的兴奋性毒性所致的ca2+超载学说也受到挑战。虽然细胞凋亡时，大多数情况下，细胞内钙离子浓度是增高的，而且这可能是凋亡中的某些环节所必需[9]。但是，另一方面，通过多种途径提高细胞内钙离子浓度又可以减轻培养的神经元细胞的凋亡，如在培养基中加入低浓度的n甲基d门冬氨酸(nmethydaspatrate，nmda)[10],激活电压门控的钙离子通道[1]等措施。
实验发现：在培养的交感神经元，抑制神经元凋亡的钙离子水平为180～240 nmol·l-1[17]，这比在许多细胞中引起细胞中毒的钙离子浓度水平(>5 μmol·l-1)[11]要低得多。年青的、生长因子依赖性很大的交感神经元，其细胞内钙离子浓度比对生长因子依赖性很小的年老交感神经元细胞内钙离子浓度要低。johnson em 等因此提出了一个神经细胞的存活和轴突的生长依赖于细胞内一个适宜的钙浓度的钙调定点学说[1]。认为细胞可能主要有3个不同的钙离子状态：(1)低钙离子状态，此时神经元有凋亡的危险，其存活对生长因子高度依赖;(2)中等浓度钙离子状态，适合细胞的生存，对生长因子的依赖性很小;(3)高钙离子状态，具有细胞毒性[11，13]。
据钙调定点学说，可以推测缺血后谷氨酸受体(glutamate receptor，glur2 /glurb) 表达下调引起钙离子内流，可能具有细胞保护作用;而且，近年来的研究也表明，短暂的前脑缺血3 d后，细胞内钙离子浓度没有增高，并且电压门控钙通道电流是降低的[14]。koh jy 等报道，皮层神经元持续暴露于电压门控钙离子通道拮抗剂中，或者降低培养基中钙离子浓度都能引起细胞凋亡，这与钙调定点学说一致[15]。
nmda本身也可以减少细胞凋亡，而nmda受体拮抗剂类药物则能增加培养细胞和发育中的啮齿类神经细胞的凋亡。这些结果表明nmda受体拮抗剂类药物对缺血性脑损伤的治疗可能具有双刃剑的效果：一方面可降低由于钙超载引起的兴奋性神经元的坏死; 另一方面则可加重其他细胞内的钙离子缺失而引起细胞凋亡[16]。
李晓明等发现对缺血特别敏感的海马ca1区锥体神经细胞l型钙通道活性在脑缺血再灌流早期呈瞬时升高(电流增大、开放概率和频率上升)，而在再灌流后期和晚期却持续性降低(电流减小、开放概率和频率下降)，即先激活后抑制，而对缺血不敏感的海马ca3区神经元则无此现象。此外，海马ca1区锥体神经细胞l型钙通道活性可被细胞外氧化还原状态所调节。细胞外处于高氧化的状态时，l型钙通道活性明显受抑制，细胞外处于高还原的状态时，l型钙通道活性受激活(电流增大)，这在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上呈得更明显。抗氧剂在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上能更显著地增大全细胞l型电压敏感钙通道电流。提示缺血后晚期l型电压敏感钙通道的抑制可能是由于通道被氧化所致，且这种抑制可能与自由基参与海马ca1区锥体神经元缺血性神经元迟发性死亡的机制之一[17]。
总之，虽然钙超载和钙缺失是两个相反的状态，但缺血后的不同时间和不同区域，两种情形都可出现，兴奋毒性的钙超载可能主要出现于缺血早期和缺血中心区，而钙缺失和细胞凋亡可能主要出现在缺血后期和缺血边缘区。不同时间和不同区域，不同的损伤程度细胞内的钙离子浓度水平不一样，其细胞命运也不一样。可见细胞内钙的水平与缺血性神经元损伤的关系相当复杂[1，11]。
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清均能增加海马锥体神经细胞l型钙通道的电流幅度，提示它们对海马锥体神经细胞l型钙通道有激活增强作用。作用强度柿叶黄酮大于脑心清，提示黄酮类是其增加l型钙通道电流的主要活性成分。
脑心清所含黄酮类和酚酸类成分是其抗脑缺血神经保护的重要活性成分。黄酮类成分和酚酸类成分是天然抗氧化剂，能改善细胞的氧化还原状态和促进细胞抗氧化基因表达[7]，将有助于维护l型电压依赖性钙通道的正常功能，这对缺血再灌注时缺血敏感神经元的存活有重要保护意义，可能是脑心清抗脑缺血损伤的药理机制之一。但脑心清及其黄酮成分对l型电压依赖性钙通道的作用是直接激活，还是通过改变细胞外氧化还原状态而激活，还有待进一步研究。
【参考文献】
[1] johnson e m j r,koike t,franklin j. a "calcium setpoint hypothesis" of neuronal dependence on neurotrophic factor[j]. exp neurol，1992，115:163-166.
[2] tymianski m,tator c h. normal and abnormal calcium homeostasis in neurons: a basis for the pathophysiology of traumatic and ischemic central nervous system injury[j]. neurosurgery，1996，38:1176-1195.
[3] thompon s m,wong r k. development of calcium current subtypes in isolated rat hippocampal pyramidal cells[j]. j physiol，1991,439:671-689.
[4] dea k f,lasztoczi b,pacher p，et al. inhibition of voltagegated calcium channels by fluoxetine in rat hippocampal pyramidal cells[j]. neuropharmacol，2000，39:1029-1036.
[5] west a e,chen w g,dalva m b,et al. calcium regulation of neuronal gene expression[j]. proc natl acad sci usa，2001，98: 11024-11031.
[6] bei w j，peng w l，xu a l，et al. neuroprotective effects of a standardized extract from leaves of diospyros kaki in middle cerebral artery occlusion (mcao) transient focal cerebral ischemic rats and in cultured neurons injured by glutamate or hypoxia[j]. planta medica,2007,73：636-643.
[7] bei w j,pen w l,ma y,et al. flavanoids from leaves of diospyros kaki protect primary neuron culture from injury induced by oxidative stress[j]. life science,2005,76:1975-1988.
[8] hamill o p,marty a,neher e,et al. improved patchclamp techniques for highresolution current recording from cells and cellfree membrane patches[j]. pflügers archiv, 1981,391:85-100.
[9] mcconkey d j,orrenius s. the role of calcium in the regulation of apoptosis[j]. j leukoc biol,1996,59: 775-783.
[10] balazs r,jorgensen o s,hack n. nmda promotes the survival of cerebellar granule cells in culture[j]. neuroscience,1988,27:437-451.
[11] hwang j y,kim y h,ahn y h,et al. nmethyldaspartate receptor blockade induces neuronal apoptosis in cortical culture[j]. exp neurol,1999,159(1):124-130.
[12]hansen h h,briem t,dzietko m,et al. mechanisms leading to disseminated apoptosis following nmda receptor blockade in the developing rat brain[j]. neurobiol dis,2004,16(2):440-453.
[13] hyrc k,handran s d,rothman s m,et al. ionized intracellular calcium concentration predicts excitotoxic neuronal death: observations with lowaffinity flurescent calcium indicators[j]. j neurosci,1997,17:6669-6677.
[14] connor j a,razaniboroujerdi s,greenwood a c,et al . reduced voltage dependent ca2+ signaling in ca1 neurons after brief ischemia in gerbils[j]. j neurophysio,1999,81:299-306.
[15] koh j y,cotman c w. programmed cell death: its possible contribution to neurotoxicity mediated by calcium channel antagonists[j]. brain res,1992,587(2):233-240.
[16] ikonomidou c,bosch f,miksa m,et al. blockade of nmda receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain[j]. science,1999,283: 70-74.
[17] 李晓明. l型钙通道在脑缺血后海马神经元迟发性死亡中的作用[d]. 广州: 第一军医大学,2003.
