【摘要】 目的 制备浅蓝菌素脂质体并研究其对her2/neu(erbb2)原癌基因过表达肿瘤细胞株体外增殖的影响。方法 采用超声薄膜分散法制备浅蓝菌素脂质体；正交设计优化处方；hplc法测定药物包封率及脂质体中药物浓度；离心加速实验及冷藏实验考察脂质体稳定性；活细胞计数法测定细胞生长曲线；mtt法测定游离浅蓝菌素及浅蓝菌素脂质体对细胞的增殖抑制作用。结果 浅蓝菌素脂质体的平均粒径为134.3 nm，稳定性良好，最佳处方条件下药物包封率为(53.45±3.67)%，脂质体中药物质量浓度为(1.126±0.065) mg/ml，剂量依赖性抑制skbr3和skov3细胞的增殖，ic50分别为9.62和9.32 μmol·l-1。结论 该制备工艺和处方可行，所制备的浅蓝菌素脂质体对skbr3细胞和skov3细胞有明显的增殖抑制作用，且作用强于游离浅蓝菌素。
【关键词】 浅蓝菌素 脂质体 包封率 肿瘤细胞 ic50
abstract:objective to optimize the preparation of cerulenin iposomes and investigate the effect of cerulenin liposomes on proliferation of tumor cells overexpressing her2/neu in vitro. methods cerulenin embedded in liposomes was assayed by hplc and the embedding rate of cerulenin was calculated. particle size and distribution of cerulenin liposomes were investigated by laser scatter and stability of liposomes was investigated by centrifugal acceleration experiment and deep freezing. the growth curves of cells treated with cerulenin liposomes at different concentrations were determined by counting the cell number and ic50 of cerulenin liposomes was determined by mtt method. results the average diameter of cerulenin liposomes was 134.3 nm with good stability. the embedding rate of cerulenin into liposomes was 53.45%, and the concentration of cerulenin in liposomes was 1.126 mg/ml. the liposomes inhibited the growth of skbr3 and skov3 cells in vitro in a dosedependent manner and the ic50 of cerulenin liposomes on skbr3 and skov3 cells was 9.62×10-6 and 9.32×10-6 mol/l respectively. conclusion the cerulenin liposomes that were prepared with the modified formulation inhibited the proliferation of skbr3 and skov3 cells in vitro with ic50 less than those of free cerulenin.
key words:cerulenin; liposomes; embedding rate; tumor cells; ic50
近年来研究发现脂肪酸合成酶(fas)在多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌中呈高表达，并且与肿瘤的恶性程度及预后相关［1，2］。www.11665.Comfas的抑制剂浅蓝菌素通过与脂肪酸合成酶复合体系的β酮脂酰acp合酶末端丝氨酸的sh结合，形成内酰胺从而使fas失活，但只有her2/neu(erbb2)原癌基因过表达的肿瘤细胞株才对浅蓝菌素敏感［1］。
浅蓝菌素(cerulenin, ce)为浅蓝头孢霉菌的次级代谢产物，研究发现其也可从多种微生物及动物组织中分离提取［3］。除了用于治疗肥胖症外，近几年还发现浅蓝菌素具有抗真菌［4］、抗病毒［5］、抗癌［6］等药理作用，引起了研究者的极大兴趣。但该化合物水溶性差（溶解度约为0.3 mg/ml）、毒副作用较强，且化学性质不稳定。研究表明，脂质体作为药物载体可以有效地降低毒副作用，且免疫脂质体可以将药物靶向释放到靶分子［7］。本研究制备了浅蓝菌素脂质体(cel)，对其稳定性进行考察；并以her2/neu(erb b2)过表达的肿瘤细胞株skbr3和skov3为实验对象，考察cel对细胞体外增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
shimadzu lc10atvp高效液相色谱仪(日本岛津)； c18 ods分析柱(diamonsiltm, 5 μm, 150 mm×4.6 mm，北京迪马科技有限公司)；revco 3000 细胞培养箱(美国revco公司)；model 312分光光度平板读数计(biotech research laboratories inc.)；re52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；bi90型激光粒度分析仪(brookheven co., usa)；sigma 3k18低温高速离心机（德国sigma公司）；jy250探头式超声仪(浙江三门超声波仪器厂)。
浅蓝菌素(sigma inc., 纯度>98％)；胆固醇(上海生物化学试剂公司)；大豆卵磷脂(上海油脂一厂)；mem培养基(hyclonetm, thermo fisher scientific inc.)；胎牛血清(fbs，杭州四季青生物工程材料有限公司)；非必需氨基酸(amresco inc., usa)； 胰蛋白酶(amresco inc., usa)；甲醇(色谱纯，天津南开化学试剂有限公司)；mtt(sigma inc.)；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞培养
skbr3乳腺癌细胞株和 skov3 卵巢癌细胞株购自于中国医学科学院肿瘤研究所(atcc number分别为htb30tm和htb77tm)。常规培养于含10%胎牛血清、2 mmol·l-1 l谷氨酰的改良mem培养基中。培养条件：5%co2、95%湿度、37 ℃。每周传代2次。待细胞基本长满后，弃去旧培养基，以适量0.25%胰蛋白酶和0.02%edta(体积比为1∶1)将细胞消化约1 min，弃去消化液并加入适量含10%fbs的mem培养基，反复吹打后制备细胞悬液，以1∶4的比例传代。
1.3 浅蓝菌素标准曲线测定
浅蓝菌素标准工作液的浓度分别为0.5、2、10、50、200、1 000 μmol·l-1。 hplc法测定浅蓝菌素的含量［7］：diamonsiltm ods色谱柱(c18, 150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为乙腈磷酸二氢钾(10 mmol·l-1,ph 3.0)(体积比40∶60)；流速为1 ml·min-1；检测波长为210 nm；进样量为10 μl。测定各浓度下浅蓝菌素峰面积，并以originpro 7.5软件拟合浓度峰面积标准曲线。
1.4 浅蓝菌素脂质体(cel)的制备
采用超声薄膜分散法制备cel。将一定比例的卵磷脂、胆固醇和浅蓝菌素的三氯甲烷溶液混合后置梨形瓶中，减压旋转蒸发去除有机溶剂，制成均匀的脂质干膜，并以n2吹干残余有机溶剂。加入10 mmol·l-1的pbs 5 ml，充n2密封后使脂质干膜充分溶胀水化。冰水浴超声30 min后，探头式超声仪超声整粒3 min。将脂质体溶液以0.22 μm微孔滤膜过滤后转移至透析袋中,置100倍体积的生理盐水中于4 ℃下透析, 12 h后更换介质继续透析至24 h，以除去游离浅蓝菌素。
1.5 处方优化
以药物包封率为评价指标，按照三因素三水平正交设计表(表1和表2)进行正交试验，以确定最佳处方。
表1 因素水平表（略）
table 1 factors and levels
表2 cel处方优化三因素三水平正交试验表（略）
table 1 l9(33) orthogonal design for optimization of cel formulation
1.6 包封率及含量测定
取透析后的脂质体制剂10 μl，以甲醇破坏并稀释1 000倍。取稀释液10 μl，hplc分析测定浅蓝菌素峰面积，并代入直线回归方程计算药物浓度，根据投药量(投药量为10 mg)按公式:包封率＝w内/w总×100%计算药物包封率。式中，w内：包封在脂质体内的药物量；w总：投入的药物总量。
1.7 cel的稳定性研究
离心加速实验：将制得的脂质体样品稀释后进行离心加速实验［9］(10 000 r·min-1，30 min)，分光光度法测定脂质体样品离心前后500 nm处的吸光度变化，根据公式:ke = (a0-a)/a0计算稳定性参数。式中，a0: 脂质体稀释液的吸光度；a: 脂质体稀释液离心后的吸光度。
冷藏实验：将cel适当稀释后以n2密封于安瓿瓶中，分别储存于4 ℃的冰箱中及25 ℃的恒温箱中。分别于第30、60、90天取样，透析去除渗漏出来的药物，hplc法测定仍包封在脂质体中的药物含量，按公式:p= (c0-c)/c0×100%计算渗漏率。式中，c0为冷藏实验开始前脂质体的药物含量，此处为1.126 mg/ml；c为储存不同时间后每毫升脂质体中的药物含量。
1.8 cel对肿瘤细胞生长的影响
分别将skbr3细胞和skov3细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔10 000个细胞。过夜贴壁后，实验组加入cel(终浓度分别为5、10、20 μmol·l-1)，对照组补加等体积的培养基，分别于第24、48、72、96 h取样，4%台盼蓝活细胞拒染法计算各组活细胞数，绘制细胞生长曲线。于96孔板中采用常规mtt方法，分别测定浅蓝菌素及cel对skbr3和skov3细胞的体外增殖抑制作用
2 结果
2.1 浅蓝菌素标准曲线
浅蓝菌素的保留时间为12.7 min；吸收峰面积（a）与药物浓度(c) 之间的直线回归方程为a=3.5784c+0.1592(r2=0.999 7, n=5)，表明药物浓度在0.5×10-6～1000×10-6 mol·l-1范围内线性关系良好；确定最低检测限为0.4 ng。
2.2 cel粒度分布
将cel稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明, 脂质体平均粒径为134.3 nm，粒度分布基本符合正态分布规律(图1)。
图1 cel的粒度分布（略）
figure 1 particle size distribution of cel
2.3 正交实验结果及评价
以药物包封率为评价指标，分析正交实验结果（见表2）。各因素对包封率的影响大小依次为：因素b(药物与总脂质的摩尔比)>因素a(卵磷脂与胆固醇的质量比)>因素c(溶胀用pbs的酸碱度)。最佳配方为a2b2c3，即卵磷脂∶胆固醇(质量比)为5∶1，浅蓝菌素∶总脂质(摩尔比)为1∶8，pbs的ph值为7.4。
2.4 cel的包封率测定
将优化处方条件下制备的cel透析去除游离浅蓝菌素后，测定包封在脂质体中的药物含量，并根据投药量计算包封率。经测定，药物包封率为(53.45±3.67)%，药物质量浓度为 (1.126±0.065) mg·ml-1。
2.5 cel稳定性试验结果
脂质体稀释液离心前后的吸光度分别为0.463和0.437，计算得ke值为0.056。可见脂质体离心前后吸光度变化很小。
冷藏实验结果见表3。结果表明，在4 ℃保存条件下，放置3个月后，脂质体未出现沉淀，药物渗漏率小于5%，具有良好的稳定性。
表3 不同温度保存时cel的稳定性 (n=3)（略）
table 3 stability of cel stored at different temperatures
2.6 cel对skbr3和skov3细胞生长的影响
cel作用较长时间后，细胞生长明显受到抑制，且随着剂量的加大，抑制作用明显增强。作用48 h时，10 μmol·l-1 cel对skbr3和skov3细胞的生长抑制率分别为45.12%和46.56%，20 μmol·l-1 cel处理时可达64.49%和75.03%。结果见图2。
■ 对照组; ○ 5 μmol·l-1 cel处理组; ▲ 10 μmol·l-1 cel处理组; ▽ 20 μmol·l-1 cel处理组
图2 不同浓度cel处理时skbr3细胞(a)和skov3细胞(b)的生长曲线（略）
figure 2 growth curves of skbr3 cells (a) and skov3 cells (b) treated by cel at different concentrations (n=3)
mtt实验结果显示，浅蓝菌素和cel均呈剂量依赖性抑制skbr3和skov3细胞的体外增殖；且cel对细胞的增殖抑制作用强于游离浅蓝菌素。cel对skbr3和skov3细胞的ic50分别为9.62和9.32 μmol·l-1，而游离浅蓝菌素对skbr3和skov3细胞的ic50分别为25.27和28.86 μmol·l-1。结果见图3。
■ 不同浓度cel处理组; ○ 不同浓度游离浅蓝菌素处理组
图3 不同浓度游离浅蓝菌素和cel对skbr3细胞(a)和skov3细胞(b)增殖作用的影响（略）
figure 3 the effects of free cerulenin and cel at different concentrations on proliferation at skbr3 cells (a) and skov3 cells (b) (n=3)
3 讨论
本研究将所制备的cel用0.22 μm的微孔滤膜过滤后再透析并进行其他一系列实验，而不是用0.45 μm微孔滤膜过滤，是因为进行细胞生长抑制实验时试剂也必须经过滤除菌，故粒径大于220 nm的脂质体无法用于细胞实验。实验中也测定了经0.45 μm微孔滤膜过滤后的药物包封率和每毫升cel中的药物质量浓度，结果包封率为(59.36±3.67)%，药物质量浓度为(1.208±0.104) mg/ml，均略高于经0.22 μm微孔滤膜过滤后的包封率和药物含量，但差异无显著性。其原因可能是粒径大于220 nm的脂质体所占比例较小，故对包封率和每毫升脂质体中药物含量的影响较小。由图1也可以看出，脂质体粒径分布并不完全符合正态分布，粒径小于平均粒径的脂质体所占比例略大一些，表明经0.22 μm微孔滤膜过滤后，粒径大于220 nm的脂质体已被排除。
本研究曾对浅蓝菌素的hplc测定方法进行了方法学考察（有关方法学数据拟另文发表）。按照参考文献［8］的方法进行分析，发现浅蓝菌素在210 nm处有特征吸收峰，保留时间约为12.7 min，呈独立峰，无干扰，测定方法专属性良好。将浅蓝菌素配制成2×10-6、50×10-6、1 000×10-6 mol·l-1的稀释液各5 份, hplc分析后, 根据标准曲线方程计算样品中浅蓝菌素的含量, 计算rsd分别为2.76%、1.04%、1.89%，回收率分别为(98.26±2.97)%、(101.19±0.92)%和(102.46±1.86)%。制备的脂质体经透析后，14 000 r/min、4 ℃离心1 h，取上清液进行分析，未检测到浅蓝菌素峰，由此证明游离药物经透析后完全去除。对脂质体的稳定性考察结果表明，4 ℃保存30 d时药物渗漏率不到1％，故认为4 ℃透析24 h造成包封药物的渗漏可忽略。
mtt实验证实，cel对skbr3和skov3细胞的体外增殖抑制作用明显强于游离浅蓝菌素(见图3)，其ic50分别是游离药物的1/2.6和1/3.1，其机制可能与增加肿瘤细胞药物摄取量有关。首先脂质体及其包裹药物与肿瘤细胞主要通过细胞膜融合作用而被肿瘤细胞内吞［10］，因而肿瘤细胞能有效摄取脂质体，与游离药物进入细胞的方式相比，该方式能增加肿瘤细胞内的药物摄取量。其次，经脂质体包裹后，单位体积样品中药物含量明显增加，本实验中，每毫升脂质体中含浅蓝菌素为1.126 mg，而游离浅蓝菌素在水中的溶解度很小（约为0.3 mg/ml）。增加投药量但不改变溶胀体积是否能进一步增加单位体积中的药物含量，尚有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ menendez ja, vellon l, mehmi i,et al. inhibition of fatty acid synthase (fas) suppresses her2/neu(erb b2) oncogene overexpression in cancer cells［j］. pnas,2004,101(29):10715-10720.
［2］ visca p, sebastiani v, botti c, et al. fatty acid synthase (fas) is a marker of increased risk of recurrence in lung carcinoma［j］. anticancer res, 2004,24(6):4169-4173.
［3］ omura s. cerulenin［j］. methods enzymol,1981,72: 520-532.
［4］ chayakulkeeree m, rude t h, toffaletti d l, et al.fatty acid synthesis is essential for survival of cryptococcus neoformans and a potential fungicidal target［j］. antimicrob agents chemother,2007,51(10): 3537-3545.
［5］ rassmann a, henke a, jarasch n, et al. the human fatty acid synthase: a new therapeutic target for coxsackievirus b3induced diseases［j］. antiviral res, 2007, 76(2): 150-158.
［6］ ho t s, ho y p, wong w y, et al. pharmacokinetics and safety of a unilamellar liposomal formulation of amphotericin b (ambisome) in rabbits［j］. biomed pharmacother,2007,61(9):578-587.
［7］ tomoda h, igarashi k, tanaka y, et al. pharmacokinetics and safety of an unilamellar liposomal formulation of ampho2tericin b (ambisome ) in rabbits ［ j ］. antimicrob agents chemother,1994,38(4):713-718.
［8］ hiroshi t, kazuaki i, yoshitake t, et al. biosynthetic preparation of labeled cerulenin with high specific radioactivity［j］.j antibio,1987,11(10):1457-1460.
［9］ 张奇，邓英杰.冻融法制备5氟尿嘧啶脂质体及其稳定性考察［j］.沈阳药科大学学报，2000,17(2):87-89.
［10］ gabizon a, goren d, barenholz y. investigations on the antitumor efficacy of liposomeassociated doxorubicin in murine tumor models［j］.isr j med sci,1988,24(9-10):512-517.
