【摘要】 目的 探讨survivin基因对曲古菌素a(tsa)诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。方法 (1)将本实验室已构建成功的survivin正义全长真核表达质粒(pcdna3.1survivin)，经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞a2780，以转染pcdna3.1空载体的a2780细胞为对照。(2)rtpcr和western blot方法分别检测survivin mrna和蛋白质的表达。(3)mtt比色法和流式细胞仪(facs)分别检测tsa对两组细胞存活率和凋亡率的影响。(4)western blot检测tsa作用下a2780细胞中survivin蛋白的表达变化。结果 (1)rtpcr和western blot检测提示转染pcdna3.1survivin组中survivin mrna和蛋白质表达明显高于空载体组。(2)mtt比色法和facs检测提示转染pcdna3.1survivin组细胞存活率明显高于空载体组,细胞凋亡率明显低于空载体组，差异有统计学意义(p<0.05)。pcdna3.1survivin转染后的a2780细胞对tsa的敏感性明显降低。(3)western blot检测提示survivin的表达水平随着tsa作用时间的延长而下降。结论 曲古菌素a诱导卵巢癌细胞的凋亡作用可能与survivin基因表达有关。
【关键词】 survivin基因;卵巢肿瘤; 曲古菌素a; 细胞凋亡
effect of eukaryotic expression of survivin on apoptosis of ovarian cancer cell induced by trichostatin a
ma xiaoli，xing hui，wu peng，weng danhui，lu yunping，ma ding
department of obstetrics and gynecology, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china
corresponding author：ma ding，email：[email protected]：objective to investigate the effect of survivin expression on apoptosis of ovarian cancer cells induced by trichostatin a(tsa). methods (1)a2780 cells were transfected with pcdna3.1survivin(fulllength survivin cdna) which has been successfully constructed in our laboratory. a2780 cells transfected with pcdna3.1 were cultured as controls.(2)the expression of survivin mrna and protein was detected by rtpcr and western blot, respectively. (3)two cell groups were treated with tsa and analyzed for suvival and apoptotic rate by mtt assay and flow cytometry (facs). (4)expression of survivin protein was detected under tsa treatment by western blot. results (1)the level of survivin mrna and protein in transfected cells transfected with pcdna3.1survivin was significantly higher than that in control cells detected by rtpcr and western blot.(2)the viable rate of cells transfected with pcdna3.1survivin was obviously higher than that of control cells and the apoptotic rate was significantly lower than control detected by mtt assay and facs, respectively(p<0.05). the sensitivity of a2780 cells transfected with pcdna3.1survivin to tsa was greatly reduced.(3)the expression of survivin in a2780 cells obviously decreased with tsa incubation time. conclusion apoptosis of ovarian cancer cells induced by tsa may be related to the expression of survivin gene.
key words：survivin;ovarian neoplasms;trichostatin a;apoptosis
卵巢癌在女性生殖器肿瘤中预后最差,极易转移和复发,这与卵巢癌化疗耐药密切相关。Www.11665.cOmsurvivin基因是一种细胞凋亡抑制基因,位于17q25,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，iaps)中的一员[1]。它表达于胚胎和胎儿组织及绝大多数肿瘤组织，但在成人终末分化组织(胸腺、生殖器除外)无表达[2] 。它参与了恶性肿瘤的发生、发展和凋亡抵抗,使其成为值得关注的抗癌治疗靶基因。曲古菌素a( trichostatin a, tsa)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,通过改变瘤细胞染色体上组蛋白去乙酰化水平,影响多种基因的表达水平,从而诱导细胞周期阻滞和凋亡[3]。本实验将survivin的正义全长真核表达质粒(pcdna3.1survivin)转染人卵巢癌细胞a2780，探讨survivin基因对曲古菌素a(tsa)诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料和试剂 人卵巢癌细胞株a2780由武汉大学中国典型物种保藏中心提供;小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;trizol试剂和培养基rpmi1640购自美国gbico brl公司;曲古菌素a购自sigma公司;survivin兔抗人单克隆抗体购自santa cruz公司;四甲基偶氮唑盐(mtt, 5mg/ml, pbs配制)购自amresco公司;脂质体lipofectaminetm2000购自invitrogen tm公司;survivin正义全长真核表达质粒(pcdna3.1survivin)为本实验室保存[4];pcr引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.1.2 主要仪器 酶标仪为美国biorad2550型;流式细胞仪(facscan becton dickinson)为美国公司产品;western blot电转仪(biometra,german)为德国公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株a2780培养于含10%新鲜小牛血清的rpmi 1640培养基中,置于37℃, 5%co2, 相对湿度90%的培养箱中培养,细胞呈贴壁生长。
1.2.2 转染 脂质体lipofectaminetm2000包裹已构建好的pcdna3.1survivin重组体和pcdna3.1空载体，将a2780细胞以1×106/ml接种6孔板，待其生长至70%～80%融合时开始转染，转染方法参考gibco brl操作手册，所用pcdna3.1survivin的量为4.0μg/孔，脂质体10μl/孔，孵育6h后终止转染，g418筛选稳定转染pcdna3.1survivin的a2780细胞(a2780survivin)和稳定转染pcdna3.1的a2780细胞(a2780con)。
1.2.3 rtpcr检测survivin mrna转录水平的变化 收集a2780survivin和a2780con细胞，按trizol试剂一步法提取细胞总rna。用mmlv逆转录酶进行逆转录，将mrna转录为cdna。内源对照gapdh基因上、下游引物碱基序列分别为：5′acg gat ttg gtc gta ttg gg3′和5′tga ttt tgg agg gat ctc gc3′，产物长度为230bp, 循环条件：预变性95℃ 3min，变性94℃ 30s, 退火56℃ 30s, 延伸72℃ 30s, 共32个循环, 最后72℃再延伸10min。survivin基因上、下游引物碱基序列分别为：5′ccg cat ctc tac att caa g3′和5′cca gag gcc tca atc cat3′，产物长度为370bp，循环条件：预变性94℃ 3min, 变性94℃ 30s, 退火55℃ 1min, 延伸72℃ 1min 30s, 共35个循环, 最后72℃再延伸10min。pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后eb染色, 紫外灯下观察结果，照相, 图像经uvpgrabit image软件采集, 计算各条带asurvivin/agapdh的比值,以此作为survivin mrna的相对表达量。
1.2.4 western blot检测survivin蛋白质水平的变化 收集a2780survivin和a2780con细胞，裂解并提取蛋白, 采用考马斯亮蓝g250染料法进行蛋白定量。100μg总蛋白进行10%sdspage凝胶电泳, 以蛋白电泳转移仪(biometra, german)将蛋白转至nc膜上, 脱脂奶室温封闭2h，加入1∶500兔抗人survivin，4℃反应过夜, tbst洗膜, 加入1∶500碱性磷酸酶标记的二抗37℃孵育1h，nbt/bcip系统显色30min。图像经uvpgrabit image软件采集, 计算各条带asurvivin/aβactin的比值，以此作为survivin 蛋白的相对表达量。
1.2.5 tsa敏感性的检测 (1)mtt比色法检测细胞存活率：将a2780survivin和a2780con细胞分别接种于96孔板中, 调整细胞浓度，每孔接种8 000个细胞。tsa作用48h(浓度梯度250、500、750、1000nm)后, 每孔加mtt(5mg/ml)10μl作用2h, dmso 200μl作用30min后,酶标仪570nm处测定每孔吸光度(a)值,每个浓度设5个复孔, 计算细胞存活率(%)=各浓度组吸光度值/空白组吸光度值×100%, 并绘制生存曲线。(2)facs检测细胞凋亡：将两组细胞接种于6孔板中, 用浓度2μm的tsa作用12h、24h后消化、收集细胞，1 000r/min离心8min，弃上清, 用冰预冷75%乙醇固定, 过夜。离心, 弃上清。pbs洗两遍。调整细胞浓度, 依次加入rna酶、pi，避光保存30min, 上机检测细胞凋亡。以上实验均重复3次。
1.2.6 tsa处理后survivin表达测定 a2780细胞接种于6孔板, 待细胞融合度达到约50%～60%时,用2μm tsa分别处理0、6、12、24h, 收集细胞, 用western blot法检测survivin蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法
实验数据以±s表示, 采用配对t检验，p<0.05为差异有统计学意义，应用spss10.0软件包对实验数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 a2780survivin组和a2780con组中survivin表达的比较
分别收集a2780survivin组中的2个细胞克隆(c1，c2)和a2780con组的1个细胞克隆(c0)。rtpcr结果显示a2780survivin组中survivin mrna相对表达量明显增高(p<0.05), c0～c2的asurvivin/agapdh比值分别为(0.26±0.04)、(1.85±0.06)和(1.02±0.05)，见图1。western blot结果显示a2780survivin组中survivin蛋白相对表达量明显增高(p<0.05)，c0～c2的asurvivin/aβactin比值分别为(0.26±0.05)、(0.63±0.08)和(0.52±0.11)，见图2。结果表明，a2780survivin组中survivin的表达明显高于a2780con组。
2.2 a2780survivin组和a2780con组的tsa敏感性的比较
2.2.1 细胞存活率的比较 mtt比色法结果显示，a2780survivin细胞和a2780细胞经浓度为250、500、750、1 000nm的tsa作用后，a2780survivin细胞的存活率明显高于a2780con细胞(p<0.05)，见图3。
2.2.2 细胞凋亡率的比较 facs结果显示，a2780survivin细胞和a2780con细胞经2μm的tsa作用后，a2780survivin细胞凋亡率为(15.78±2.24)%，明显低于a2780con细胞(36.55±2.86)%(p<0.05)。
2.3 tsa处理后a2780细胞中survivin表达的变化
western blot结果显示tsa处理a2780细胞后survivin的表达逐渐下降，0、6、12、24h asurvivin/aβactin的比值分别为(0.25±0.10)、(0.22±0.12)、(0.17±0.08)和(0.09±0.01)(p<0.05)，见图4。
3 讨论
细胞凋亡的抑制在肿瘤发生发展及耐药形成中具有重要作用。肿瘤细胞可通过增高凋亡阈值,降低凋亡刺激因子诱导的细胞凋亡敏感性,从而导致细胞凋亡耐受的发生[5]。染色质的结构改变是真核细胞基因表达调控的一个重要机制,核小体dna 序列的完整组装以及染色质序列的高度有序确保了基因转录的正常进行,当核小体组蛋白乙酰化水平发生变化时可影响特定转录因子的活性,从而调节相关基因的转录与表达[6]。正常细胞中组蛋白乙酰基转移酶( histone acetyltransferase, hats) 和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, hdacs) 的活性处于平衡状态，调节组蛋白的乙酰化水平,保证相应基因正常表达。hdac抑制剂是一类通过抑制hdacs 活性而改变染色质结构在转录水平对基因表达进行调控的化合物。曲古菌素a是一种由抗真菌药物衍生而来的hdacs 活性的强效非竞争性抑制剂,对血液系统肿瘤和实质性肿瘤均有较强的抑制作用[7]。能抑制组蛋白去乙酰化酶,使乙酰化程度增高,重塑染色质为转录活性结构, 影响多种基因的表达水平,从而诱导细胞周期阻滞和凋亡。研究证实,无论是在体内还是体外, tsa 均可以诱导实体肿瘤细胞生长阻滞、分化和凋亡。
业已证明,凋亡抑制蛋白可以抑制细胞凋亡。iaps 家族中的某些成员可以直接通过和细胞凋亡终末效应因子caspase3、caspase7前体结合抑制其活性从而抑制细胞凋亡[8]，保护肿瘤细胞免受凋亡损伤。survivin是iaps家族中分子量最小的成员,是迄今发现的最强凋亡抑制因子。研究证明,过度表达的survivin可保护细胞免受受体或损伤引起的凋亡[9]。因此, survivin过表达与肿瘤耐药形成有关,并有可能成为肿瘤治疗的理想分子靶点。
本研究中, 我们将survivin的正义全长真核表达质粒(pcdna3.1survivin)转染人卵巢癌细胞a2780, 上调survivin基因的表达。本实验效应检测结果表明,转染survivin正义全长真核表达质粒后,细胞存活率增高,细胞凋亡率降低，对曲古菌素a敏感性下降,表现出对曲古菌素a的耐受。此外,在曲古菌素a作用下人卵巢癌细胞a2780中survivin基因的表达呈下降趋势, 由此推测，曲古菌素a诱导的卵巢癌细胞凋亡作用与survivin的表达有关，这与以往报道一致[10]，survivin可以作为一个新的治疗靶点而被进一步研究。
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