作者：施渺筱，舒星，肖洋，蒋滔 李祝
【摘要】 目的通过正交实验优化蛹虫草培养成分，提高虫草菌素含量。方法以蛹虫草的无性型peacilomyces militaris 08-03为材料，进行正交实验。结果通过正交实验优选出的最佳培养基成分为：蛋白胨2%、酵母膏3%、麦牙糖3%、蔗糖4%、kh2po4 0.1%、nano3 0.1%、nh4cl 0.2%,140 r/min，27℃，摇瓶发酵8 d;虫草菌素含量为(0.98±0.08) mg/g。结论优化的培养基比用查氏液体培养基培养的虫草菌素产量[(6.51±0.22) mg/g]提高了近6.6倍。
【关键词】 虫草菌素; 蛹虫草; 培养基; 发酵
abstract：objectiveto optimize the media conditions of cordyceps militaris by orthogonal layout to enhance cordycepin production.methodsthe study was conducted to explore the optimum media conditions for submerged fermetation of peacilomyces militaris 08-03 to enhance cordycepin content.resultsthe optimum conditions were as follows:2% peptone,3% extraction yeast,3% maltose,4% cane sugar,0.1% kh2po4,0.1% nano3 and 0.2% nh4cl,140 r/min,27℃,fermentation for 8 days,the cordycepin production from peacilomyces militaris 08-03 mycelia would reach 6.51±0.22 mg/g.conclusionthe cordycepin production in the optimum media was 6.06 times more than the czaped(0.98±0.08 mg/g).
key words：cordyceps.militaris; cordycepin; cultural media; increasing
虫草菌素(cordycepin)即3'-脱氧腺苷(3'-deoxyadenosine)，又称蛹虫草菌素，由cunningham等于1951年从蛹虫草cordyceps militaris(linn)link的培养滤液中分离得到。wWw.11665.CoM蛹虫草菌素是第1个从真菌中分离出来的核苷类抗生素[1，2]。
虫草菌素具有多种生物学活性。虫草菌素能抑制枯草杆菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌及葡萄球菌等病原菌的生长，对石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌及须疮癣菌等皮肤致病性真菌亦有抑制作用。虫草菌素对鼠艾氏腹水癌、人鼻咽癌kb细胞、人表皮样疣和人宫颈癌hela细胞等皆具有明显的拮抗抑制作用。虫草菌素可抑制一种脑炎病毒，对人体免疫缺陷病毒hiv i型的侵染及其反转录酶的活性亦有抑制作用。另外，虫草菌素对尖音库蚊culex pipiens、埃及伊蚊aedes aegypti和另一种伊蚊a.atropalpus的幼虫也有明显致死作用[2～5]。虫草菌素的多种生物学活性引起了药学界的重视，但野生的蛹虫草中虫草菌素的含量一般不高[6，7]。因此，提高发酵菌丝体中虫草菌素的含量成为研究热点。
1 材料和方法
1.1 供试菌株蛹虫草cordyceps militari无性型，蛹草拟青霉paecilomyces millitaris 08-03菌株(以下简称08-03)，保存于安顺学院化学系。
1.2 试剂虫草菌素(cordycepin)购于美国sigma公司。其他试剂均为分析纯。
1.3 08-03菌丝体中虫草菌素含量的测定[8]精密称取08-03菌丝干粉0.2 g，置于25 ml具塞试管中，加入6倍量的20%乙醇，50℃水浴30 min，稀释并定容至25 ml，双层滤纸过滤，用hplc进行测定。
色谱柱：c18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相：0.02 mol/l乙酸铵∶甲醇(85∶15);流速0.7 ml/l;紫外检测波长260 nm;在此条件下，虫草菌素保留时间为6.66 min。
1.4 碳源的选择以蛋白胨2%，mgso4·7h2o 0.05%，kh2po4 0.1%为基础培养基，以葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、可溶性淀粉分别为5种碳源加入，制备培养基，培养基装量为20%(所有实验均用此)，将08-03接入不同的培养基中，140 r/min，27℃，摇瓶培养192h(8 d)，对比葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、可溶性淀粉分别为碳源时对虫草菌素含量及生物量的影响。
1.5 氮源的选择以蔗糖2%，mgso4·7h2o 0.05%，kh2po4 0.1%为基础培养基，对比蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、花生粉、蚕蛹粉分别为氮源时对虫草菌素含量及生物量的影响。其中豆饼粉、花生粉、蚕蛹粉经煮沸水解20 min，冷却置冰箱过夜后，取其上清液加入。
1.6 碳氮比的选择分别选出虫草菌素含量最高和生物量最高的碳源、氮源各两个为因素，不加其他任何成分，按4因素3水平设计正交实验，对比不同c/n对虫草菌素含量及生物量的影响。其因素位级见表1。表1 l9(34)正交实验因素位级表
1.7 无机盐的选择得到最适的c/n培养基，以之作为基础培养基，将kh2po4，nano3，nh4cl，mgso4·7h2o，kcl，k2hpo4这6种无机盐设为6个因素，进行6因素2水平的正交实验，对比不同无机盐对虫草菌素含量及生物量的影响，其因素位级见表2。表2 l8(26)正交实验因素位级
1.8 统计分析所有实验分别进行3次重复，所有数据通过k-s检验(spss 11.5，美国)。
2 结果与讨论
2.1 碳源的影响碳素不仅存在于微生物细胞的原生质及其代谢产物中，而且是生命活动中主要的能量来源，因此，碳素不仅需要量大，而且是基本的营养元素之一。结果(见表3)显示，蔗糖作碳源，生物量最高(20.75±0.12) g/l;麦芽糖作碳源，虫草菌素的含量最高(5.37±0.10) mg/g。所以选蔗糖、麦芽糖为碳源。表3 不同碳源的发酵实验结果
以蔗糖为碳源的生物量比葡萄糖的高，可能因为葡萄糖是单糖，前期更利于菌体的生长，但到了后期(第5天时)，菌体处于衰老期(显微镜观察，菌丝有大量空胞)，出现自溶现象，菌丝生物量下降;而蔗糖为双糖，其利用速度较葡萄糖慢，因此衰老期出现得较迟(第7天)，自溶现象不是很严重，生物量基本没下降，所以，发酵结束时(第8天)，蔗糖作碳源的生物量高于葡萄糖作碳源的生物量。
2.2 氮源的影响氮素是合成蛋白质的主要原料，而蛋白质是细胞的主要组成成分，是保持生命的基本物质，因此，氮素是微生物生长所需的主要营养源。实验结果(见表4)表明，蛋白胨作氮源，生物量最高(20.75±0.25) g/l;酵母膏作氮源，虫草菌素的含量最高(4.88±0.08 )mg/g。所以选蛋白胨、酵母膏为氮源。表4 不同氮源的发酵实验结果
2.3 c/n的影响
培养基中的碳源和氮源间的相对比例即c/n，无论是对菌丝生长还是对代谢产物的产生都有着十分重要的意义。表5 l9(34)正交实验结果及极差分析 将筛选出来的两种碳源和氮源，根据l9(34)正交实验分配表安排实验，以虫草菌素含量为检测指标，结果如表5。r值表明麦芽糖(c)对虫草菌素含量的影响最为显著，其次蛋白胨(b)，而蔗糖(d)和酵母膏(a)的影响最小。各因素的最佳组合为酵母膏以3水平，蛋白胨以2水平，麦芽糖以2水平，蔗糖以3水平即a3b2c2d3。将之确定为最佳的c/n配方，即蛋白胨2%、酵母膏3%、麦芽糖3%、蔗糖4%，摇瓶发酵08-03菌株，得虫草菌素含量(6.11±0.22) mg/g。
2.4 无机盐的影响无机元素可分为非金属元素和金属元素。非金属元素中的磷是细胞核组成分之一;金属元素中的镁、铁等离子可保证生物体内酶的最大活性，钾、钠等离子可维持细胞渗透压平衡或利于物质运输。以上这些无机元素均可参与微生物的新陈代谢，促进次生代谢产物的合成。
以最适c/n培养基即酵母膏3%、蛋白胨2%、麦芽糖3%、蔗糖4%为基本培养基，根据l8(26)正交实验表安排实验，以虫草菌素含量为检测指标，结果如表6。r值表明kcl(e)对虫草菌素含量的影响最为显著;其次为kh2po4(a);再其次为mgso4(d);而k2hpo4(f)、nh4cl(c)、nano3(b)的影响最小。各因素的最佳组合为kh2po4以2水平、nano3以2水平、nh4cl以2水平、 mgso4以1水平、kcl以1水平、k2hpo4以1水平即a2b2c2d1e1f1。表6 l8(26)正交实验结果及极差分析
因此，最佳发酵培养基组成是：蛋白胨2%、酵母膏3%、麦芽糖3%、蔗糖4%、kh2po4 0.1%、nano3 0.1%、nh4cl 0.2%，摇瓶发酵8 d，得虫草菌素含量为(6.51±0.22)mg/g，比用查氏液体培养基培养的(0.98±0.08) mg/g提高了近6.6倍。
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