作者：王文卫 陈俊星 潘俊 肖峻 林焕懿 陈凌武
【摘要】 【目的】 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素a(tsa)对人膀胱癌t24细胞的增殖抑制作用及对apaf-1、apc基因表达的影响。 【方法】 采用3 × 10-4 mmol/l tsa作用t24细胞，mtt法检测tsa对t24细胞生长的抑制作用;流式细胞术(fcm)检测tsa作用前后t24细胞周期和凋亡的变化;逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)法检测tsa作用前后膀胱癌细胞中apaf-1、apc mrna表达的变化。【结果】 tsa对t24细胞的生长具有明显的抑制作用;tsa作用后t24细胞的g0/g1期比例增加，s期比例减少，细胞凋亡率增加(p < 0.05);rt-pcr结果显示tsa处理能明显诱导apaf-1、apc基因表达增加。【结论】 tsa能抑制t24细胞体外生长，诱导细胞周期阻滞和凋亡，其可能通过诱导apaf-1、apc基因表达增加而发挥体外抗膀胱癌作用。
【关键词】 膀胱癌; 曲古霉素抑菌素a; apaf-1基因; apc基因
abstract： 【objective】 to investigate the effect of trichostatin a (tsa)， a histone deacetylase inhibitor (hdaci)， on the growth of t24 human bladder cancer cells and the expression of apaf-1 and apc in vitro， and to explore the possible mechanism. 【methods】 t24 cells were treated with 3 × 10-4 mmol/l tsa; after treatment， cell growth was measured by mtt assay; cell apoptosis changes and the cell cycle distribution were examined by flow cytometry (fcm). the expression of apaf-1 and apc mrna was detected by rt-pcr. 【results】 tsa significantly inhibited the proliferation of t24 cells; flow cytometry showed that the cells in g0/g1 phase and the apoptotic rates were significantly increased after treatment with tsa， while the cells in s phase were reduced.rt-pcr results showed that the apaf-1 and apc mrna level were promoted after tsa treatment. 【conclusion】 tsa can inhibit t24 cells growth in vitro through inducing cell apoptosis and cell cycle arrest， which might be related to the expression of apaf-1 and apc.
组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控最主要的研究内容之一，其通过改变染色质的构型调控基因转录，与恶性肿瘤具有密切的关系。wwW.11665.cOM抑制细胞内组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase， hdac)的活性，可增加组蛋白的乙酰化程度，具有抑制肿瘤细胞的生长，诱导分化和(或)凋亡的作用[1]。曲古抑菌素(trichostatin a，tsa)是一种氧肟酸类hdac抑制剂，本研究应用tsa体外作用于人膀胱癌t24细胞株，观察其细胞生物学行为改变和人凋亡蛋白酶活化因子-1基因(apoptosis protease activating factor-1，apaf-1)、结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli，apc)表达的变化，探讨tsa作用于膀胱癌的可能机制并为hdac抑制剂应用于膀胱癌治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 细胞培养及主要试剂
人膀胱移行细胞癌细胞株t24购于中国科学院上海生物细胞研究所，培养于含100 ml/l胎牛血清、100 u/ml青霉素100 mg/ml链霉素的rpmi 1640培养基。在37 ℃、体积百分比为5%co2饱和湿度条件下生长传代，实验时取对数生长期的细胞。tsa 为美国sigma 公司产品，按说明配置成储存液，用rpmi1640培养基稀释成工作液。mtt、二甲基亚砜(dmso)、碘化丙啶(pi)均购于广州威佳生物公司，凋亡试剂盒(kga108)购于南京凯基生物科技发展有限公司，trizol试剂，tag酶，逆转录酶m-mlv，rt-pcr试剂盒均购于takara公司，
1.2 细胞增殖抑制实验(mtt)测定tsa对t24细胞系增殖活性的影响
取对数生长期，以台盼蓝检测活力大于95%的t24细胞以104/孔密度接种于96孔细胞培养板，每孔体积200 μl，细胞贴壁后以无血清培养基静止24 h，实验组加入终浓度为3 × 10-4 mmol/l tsa，对照组加入等量的培养液，各组均设3复孔。置于37 ℃，体积分数为5%co2培养箱内培养，分别于24 h、48 h、72 h进行处理，每孔加入5 mg/ml mtt 20 μl/孔，37 ℃，体积分数为5% co2继续孵育4 h，小心吸弃上清，加入二甲基亚砜(dmso) 150 μl/孔，充分混匀，于bio-tek酶标仪分析490 nm 处吸光度值。用下面的公式计算抑制率：抑制率(%) = (1 - 实验组吸光度值/对照组吸光度值) × 100%。
1.3 流式细胞术(fcm)检测t24细胞周期变化
取对数生长期的t24细胞按106/孔接种于6孔细胞培养板中。培养24 h后，给予3 × 10-4 mmol/l 的tsa分别处理24、48、72 h，对照组加入等量的培养液，各组每个时间点均设3个复孔。同期培养并同期用不含edta的胰蛋白酶收集处理后的细胞，800 r/min(r = 12 cm)离心10 min，沉淀采用300 μl pbs重悬，逐滴加入700 μl预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70%，4 ℃避光固定过夜。800 × g离心10 min，去上清。pbs洗两次。重悬细胞于500 μl含100 unit/ml的rnase a的pbs缓冲液中，避光，37 ℃孵育30 min。加2 mg/ml pi至终浓度50 μg/ml，避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞周期。
1.4 流式细胞术(fcm)检测t24细胞凋亡率变化
取对数生长期的t24细胞按106/孔接种于6孔细胞培养板中。培养24 h后，给予3 × 10-4 mmol/l 的tsa处理72 h，对照组加入等量的培养液，各组均设3个复孔。同期培养并同期分别以无edta的2.5 g/l胰蛋白酶收集上清漂浮细胞和底壁细胞。加200 ?滋l binding buffer重悬，加入2 ?滋l annexinv-fitc，5 ?滋l pi，孵育后行流式细胞仪分析。
1.5 rt-pcr分析apaf-1、apc基因的表达
用终浓度为3 × 10-4 mmol/l的tsa处理t24细胞，非药物处理组作为对照，分别于24、48、72 h后收集细胞。trizol法抽提总rna。紫外分光光度仪检测所抽提rna的浓度和纯度。用mmlv-rt逆转录酶按照说明合成cdna，逆转录产物作为下步pcr模板。取逆转录cdna 产物2 μl进行pcr扩增，pcr反应总体系为25 μl，反应条件为：95 ℃预变性5 min，循环内95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，扩增35个循环后72 ℃延伸5 min。apaf-1上游引物为5′-tacaatcaggctctgggagac-3′，下游引物为5′-gtgaactggat gtgccatac-3′，rt-pcr产物为323 bp。apc上游引物为5′-tcctccaggtgaaa ggaaag-3′，下游引物为5′-gggtcacagtgttc acatac-3′，rt-pcr产物为297 bp。同时扩增β-actin作为内参照，上游引物为5′-tggcacccagc acaatgaa-3’，下游引物为5′-ctaagtcatagt ccgcctagaagca-3’，rt-pcr产物为186 bp，反应条件如上述。pcr产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统进行半定量分析。
1.6 统计学处理
实验数据用spss 13.0统计软件分析，采用单因素方差分析进行统计学分析。p < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 tsa对t24细胞增殖的影响
mtt实验可见，tsa药物对t24细胞生长增殖活性具有明显抑制的抑制作用，3 × 10-4 mmol/l tsa作用24、48、72 h抑制率分别为(16.1 ± 1.2)%、(31.8 ± 2.5)%和(36.9 ± 1.3)%(图1)。
2.2 tsa诱导t24细胞周期阻滞和细胞凋亡
与同时期对照组相比，流式细胞仪分析可见tsa作用24 h及48 h后，t24细胞g0/g1期细胞百分率升高，s期细胞百分率下降(p < 0.01);tsa作用72 h后s期细胞百分率下降，g2/m期细胞百分率较对照组升高(p < 0.01，表1)。annexin v/pi双染法检测凋亡结果显示tsa处理72 h后t24细胞凋亡率为(9.97 ± 1.83)%，同时期对照组细胞凋亡率为(5.60 ± 0.70)%，差异有统计学意义(p < 0.01)，可见tsa能诱导t24细胞凋亡增加。
2.3 tsa对t24细胞中apaf-1、apc基因mrna表达的影响
半定量rt-pcr分析显示3 × 10-4 mmol/l tsa处理t24细胞24 h后apaf-1 mrna表达较同时期对照组无明显区别，但tsa处理48、72 h后，apaf-1 mrna表达水平较同时期对照组明显升高(p < 0.05，图2)。tsa处理t24细胞24、48、72 h，apc基因mrna表达水平较同时期对照组均明显升高(p < 0.05，图3)。
3 讨 论
组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学的重要研究内容，是基因转录调控的重要机制之一，在肿瘤发生中具有重要作用。组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase， hat)和去乙酰化酶的活性平衡是调控组蛋白乙酰化的水平的重要机制，其通过改变染色体构象而影响基因转录[1]。组蛋白的异常去乙酰化将使基因表达失调，从而导致肿瘤发生，在白血病等肿瘤中已得到证实[2-3]。去乙酰化酶抑制剂tsa能增加组蛋白乙酰化水平，影响基因转录，具有抗肿瘤作用[4];还有研究发现tsa在膀胱癌细胞系、乳腺癌细胞系中能诱导全基因组和特定基因启动子的去甲基化[5]，但其具体机制仍不清楚。
tsa体外作用于肿瘤细胞能抑制肿瘤细胞增殖、促进分化、诱导细胞凋亡，对小细胞肺癌等肿瘤具有明显的抑制作用[6-7]。本研究中采用mtt法发现3 × 10-4 mmol/l tsa对膀胱癌t24细胞生长具有明显的抑制作用，fcm检测结果显示tsa作用t24细胞72 h后t24细胞凋亡率为(9.97 ± 1.83)%，同时期对照组细胞凋亡率为(5.60 ± 0.70)%，凋亡率明显升高(p < 0.01)，并且 tsa作用24 h及48 h后，t24细胞g0/g1期细胞百分率升高，s期细胞百分率下降(p < 0.01)，说明tsa可能通过诱导t24细胞凋亡和细胞周期阻滞而抑制t24细胞生长，与李功成、曲魏等的研究一致[8-9]。
已有研究发现tsa引起细胞周期阻滞可能与其上调肿瘤细胞中周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21waf1或抑制cyclin a的表达有关，而tsa诱导细胞凋亡的机制可能与其诱导肿瘤细胞中bcl-2的下调和bax的上调有关[8-9]。肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控，具有两条独立的途径：死亡受体途径和线粒体介导的凋亡途径。apaf-1是线粒体凋亡途径的关键调节因子，其结合自线粒体内释放至胞浆的细胞色素 c，进一步激活caspase-9，从而启动 caspase级联反应，引起细胞凋亡[10]。细胞色素 c/apaf-1/caspase-9 途径的激活依赖于 apaf-1基因的正常表达。本研究中经rt-pcr检测发现tsa作用72 h后t24细胞中apaf-1 mrna表达明显上调(p < 0.01)，同时伴随有细胞凋亡的明显增加，可见apaf-1表达可能受组蛋白乙酰化调节，而tsa引起细胞凋亡的机制可能与其诱导apaf-1的表达上调有关。
apc是wnt信号的下游抑制因子，间接调节一系列参与调控细胞周期和凋亡的基因的表达，如cylind1、c-myc、c-jun等。在wnt信号通路中，apc直接参与调节β-catenin在胞浆中的水平，当apc表达缺失可引起β-catenin在胞浆内聚集并转运至核内，与转录因子tef/lef结合调节c-myc等癌基因的转录，引发肿瘤[11]。在膀胱癌中，apc表达异常常与其启动子异常甲基化有关，且与肿瘤的复发和进展相关[12-13];而因突变或杂合性缺失(loh)所导致的apc表达异常则较为少见[14-15]。本研究发现tsa处理t24细胞24、48、72 h，apc基因mrna表达水平较同时期对照组均明显升高(p < 0.05)，说明apc的表达同时受组蛋白乙酰化水平调节，tsa导致的apc表达上调可能是tsa诱导膀胱癌周期阻滞和凋亡的重要机制之一。
本研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa能显著抑制膀胱癌t24细胞体外生长，诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞，其机制可能与其诱导apaf-1、apc mrna的表达上调有关。
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