作者：邓路娟 闫铭 庞宗然 李晓军
【摘要】 目的 通过观察葛根醇提物对肥胖型2型糖尿病（t2dm）大血管损伤大鼠血清可溶性血管细胞黏附分子（svcam-1）、血浆肿瘤坏死因子（tnf-α）含量变化的影响，探讨其对t2dm大血管损伤保护作用的部分机制。方法 雄性wistar大鼠30只，每日用自制的脂肪乳1 ml/100 g灌胃，3周后挑选总胆固醇（tc）、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白（ldl）增高，胰岛素敏感指数下降的肥胖大鼠，空腹6 h，尾静脉快速注射链脲佐菌素(stz)30 mg/kg，1周后血糖值高于16.7 mmol/l的大鼠作为t2dm模型，于成模后3周及6周观察胸主动脉弓的病理改变，证实t2dm大血管损伤模型复制成功。成模大鼠随机分为葛根醇提物组、盐酸二甲双胍组和模型组3组，每组各10只。另取8只正常大鼠为对照组。各组分别给予葛根醇提物0.9 g/kg；盐酸二甲双胍0.09 g/kg及等剂量自来水，治疗4周后处死各组动物，取血清、血浆分别测定svcam-1、tnf-α的含量。结果 模型组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α较正常对照组上调，葛根醇提物组及盐酸二甲双胍组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α的含量均显著降低（p<0.05）。WWw.11665.Com结论 葛根醇提物能降低t2dm血管并发症大鼠过高的血清svcam-1、血浆tnf-α的水平，有助于控制t2dm血管并发症的发生发展。
【关键词】 葛根 浸膏制剂(中药) 糖尿病 2型 胞间粘附分子 肿瘤坏死因子α 血管 损伤
【abstract】 objective to observe the effect of alcoholic extract from radix puerariae on soluble vascular cell adhesion molecule 1 (svcam-1)and tnf-αin serum of rats with large vessel injury of obese t2md, and approach the mechanism of preventing large vessel injury of obese t2md. method 30 wistar rats were fed by fat milk of 1ml/100g. after three weeks adipositas wistar rats with high levels of tc, tg and ldl, and low level of insulin sensitivity index (isi) were selected from 30 wistar rats. t2dm model of these rats were established by vena caudalis injection of stz, 30 mg/kg. rats model with large vessel injury of obese t2md were confirmed by observation of pathological change of aorta thoracica arcual. these model rats were randomly divided into alcoholic extract from radix puerariae group (receive alcoholic extract from radix puerariae, 0.9 g/kg), metformin group (receive metformin, 0.09g/kg) and model group (receive tap-water). 8 normal rats were as control group. after four weeks, these rats were executed and contents of svcam-1 and tnf-α in serum were measured. results svcam-1 and tnf-α in serum in model group were higher than those in control group. svcam-1 and tnf-α in serum in alcoholic extract from radix puerariae group and metformin group were obviously decreased in comparison with those in control group (p<0.05). conclusion alcoholic extract from radix puerariae can control development of blood vessel complication of t2dm by decreasing of svcam-1 and tnf-α in serum of rat with blood vessel complication of t2dm.
【key words】 radix puerariae; extract preparation; diabetes; type 2; cell adhesion molecule; tumor necrosis factor α; blood vessel lesion
糖尿病血管病变的早期病理特征是内皮损伤，其中肿瘤坏死因子（tnf-α）及由其介导的可溶性血管细胞黏附分子1（svcam-1）的作用较为突出。研究发现高表达的内皮黏附分子可能在加速糖尿病大血管病变方面起潜在的作用［1］，tnf-α能促进血管内皮细胞表达分泌血管细胞黏附分子1(vcam-1)等黏附分子，介导炎症细胞与内皮细胞的黏附［2］，而且这一作用在晚期糖基化终末产物(ages)的协同作用下尤为突出［3］。激活的白细胞将释放酶类、细胞毒性物质及大量的细胞因子，并可进一步刺激黏附分子的表达，形成恶性循环［2,4］。本实验试图从内皮细胞表达黏附分子、白细胞等与内皮细胞的黏附及有害炎症因子的表达变化的角度，探讨中药葛根醇提物对2型糖尿病(t2dm)大血管病变保护作用的部分机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
spf级雄性wistar大鼠，体质量（240±20）g，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。动物合格证号：scxk津2005-0001。
1.2 实验药品及试剂
葛根醇提物（1 kg葛根，加10倍量70%乙醇回流提取2次，时间为1.5、1 h，浓缩成浸膏。浸膏每ml含生药为2.44 g），由河北以岭药业集团有限公司提供；盐酸二甲双胍，250 mg/片，北京协和药厂，京卫药准字（1996）第122002号；链脲佐菌素(streptozotocin,stz) ，sigma公司产品；大鼠tnf-α、svcam-1定量eia试剂盒，尚柏生物医学技术（北京）有限公司。
1.3 仪器
multiskan-mk 3酶联免疫检测仪，美国热电公司；dnp-9272型电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司；ld5-2a，北京医用离心机厂。
1.4 方法
1.4.1 模型制备
雄性wistar大鼠30只，脂肪乳（制备：猪油20 g，甲基硫氧嘧啶1 g，胆固醇8 g，谷氨酸钠1 g，蔗糖5 g，果糖5 g，吐温-80 20 ml，丙二醇30 ml。加水定容至100 ml配成）1 ml/100 g，每日1次灌胃给药。3周后，眶静脉取血，离心血清，放免法检测血清胰岛素（ins）；全自动生化检测仪检测血脂：总胆固醇（tc）、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白（ldl）；尾静脉取血，强生血糖仪检测血糖。挑选tc、tg、ldl增高，胰岛素敏感指数下降的肥胖大鼠，空腹6 h，尾静脉快速注射stz 30 mg/kg，1周后取尾静脉血用强生血糖仪检测（随机血糖）血糖高于16.7 mmol/l的大鼠作为t2dm模型大鼠，于成模后3周及6周观察胸主动脉弓的病理改变：动脉血管电镜下见内皮细胞局部损伤严重；内皮细胞与内弹力板连接处空隙增加等，为t2dm大血管损伤模型造模成功。
1.4.2 实验分组、给药及指标检测
t2dm大血管病变大鼠按血糖结合体质量分层随机分为模型组、盐酸二甲双胍组、葛根醇提物组，每组10只，另取8只大鼠作为正常对照组。盐酸二甲双胍组（0.09 g/kg）、葛根醇提物组（0.90 g/kg）予相应药物灌胃给药，正常对照组和模型组灌胃等量自来水，每日1次，连续给药4周。实验期间除正常对照组给予普通饲料外，其余各组均给予高脂高热量饲料。4周后大鼠用30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，股动脉取血，取15 μl血清待测svcam-1，100 μl血浆待测tnf-α。
1.5 观察指标
各组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α含量。
1.6 统计学方法
用spss13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
各组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α含量比较见表1。
表1 各组大鼠治疗后血清svcam-1、血浆tnf-α比较（略）
由表1可见，与正常对照组比较，模型组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α含量升高，差异有统计学意义（p<0.05）；葛根醇提物组大鼠血清svcam-1含量差异有统计学意义（p<0.05），血浆tnf-α含量差异无统计学意义；而盐酸二甲双胍组大鼠血浆tnf-α含量差异有统计学意义（p<0.05），血清svcam-1含量差异无统计学意义。与模型组相比较，葛根醇提物组及盐酸二甲双胍组大鼠血清svcam-1、血浆tnf-α含量治疗后均明显降低，差异均有统计学意义（p<0.05）。
3 讨 论
vcam-1是血管内皮细胞等细胞表面的黏附分子，属于免疫球蛋白超家族，对细胞间的相互作用具有重要作用［5］，其膜外段裂解和廓清形成svcam-1。研究表明，t2dm患者不管有无大血管病变，其血清svcam-1含量均高于健康对照者［6］，表明t2dm患者体内存在血管内皮功能的紊乱和白细胞的激活［1］。t2dm中有大血管病变患者血清svcam-1又高于无大血管病变者，且反映动脉粥样硬化的早期客观指标颈动脉内中膜厚度(imt)与血清svcam-1呈正相关，说明可溶性黏附分子参与了t2dm大血管病变的病理过程，并可作为糖尿病大血管病变的血清学标志。t2dm引起血清svcam-1升高及其参与大血管病变的机制：一般认为糖尿病患者体内氧化应激使自由基增加，增加的自由基、血栓素a2及高血糖所引起的ages作用于血管内皮细胞导致黏附分子表达增加［7］，而高表达的黏附分子促使单核细胞黏附到血管内皮并迁移到内皮下间隙，这些单核细胞再吞噬氧化或糖化的低密度脂蛋白胆固醇形成泡沫细胞从而导致动脉粥样硬化发生与发展。
由此可见，svcam-1可作为观测糖尿病血管病变的重要指标，抑制其表达已成为防治糖尿病血管并发症、降低病死率的重要措施。
tnf-α是一种具有多效生物学效应的细胞因子，由活化单核巨噬细胞产生。能抑制机体抗凝，促进血栓形成，引起c-fos、c-jun早期反应基因的高表达［8］。tnf是细胞凋亡的诱导因素之一。实验研究发现其抑制细胞凋亡相关基因-2(bc1-2)的表达， fasmrna的表达明显增强，多种信号转导蛋白如fas相关死亡结构域蛋白(fadd)、半胱天门酶3(capase3)、半胱天门酶8(capase8)表达均增强。糖尿病时tnf mrna水平随病程的延长而升高，来源主要是单核-巨噬细胞。ages刺激其过量表达。tnf还能提高靶细胞对其它细胞生长因子的反应性；通过激活促凝血酶原，抑制抗凝蛋白c旁路及合成纤溶激活剂抑制物等作用，刺激血小板和内皮细胞释放血小板源生长因子样有丝分裂原，甚至血小板源生长因子。总之，tnf-α的高表达，引起血管内皮细胞损伤，在糖尿病血管并发症的形成和发展中起着重要作用。
一定浓度的tnf-α在体外能诱导vcam的高表达，而ages则能同步刺激tnf-α、vcam的高表达。由此我们可以推断，在糖尿病血管并发症的形成中，ages的产生是一较早期的关键的病变过程，它的形成及其受体后效应爆发了一系列后续的细胞因子及血管活性物质的异常表达，引起广泛的病理损害。
葛根为豆科多年生落叶藤本植物葛的根，性味甘、辛、凉。归脾、胃经。功效为发表解肌，升阳透疹，解热生津［9］。葛根的主要活性成分为异黄酮类化合物：如葛根素、大豆素、大豆苷等［10］。葛根素为葛根的主要活性成分之一，能够显著降低四氧嘧啶小鼠的糖耐量，对抗肾上腺素的升血糖作用［11］。葛根提取物作用于地塞米松诱导的胰岛素抵抗的3t3-l、脂肪细胞，明显降低了细胞培养基中的葡萄糖水平。说明葛根具有改善脂肪细胞的胰岛素抵抗，从而增强脂肪细胞对葡萄糖摄取利用的能力，在一定程序上从细胞水平阐明了葛根具有改善胰岛素抵抗作用［12］。葛根素能增加外周血内皮细胞(epc)的数量，且能改善epc的增殖，迁移黏附和体外血管生成能力，提示葛根素不但直接对内皮细胞具有保护作用，可能同时增加epc的数量，并改善其功能从而促进血管内皮修复［13］。
本实验中葛根醇提物能显著降低糖尿病大鼠血管并发症模型血清svcam-1、血浆tnf-α含量，其机理可能部分与其能够抑制非酶糖化反应的发生有关。同时有研究表明血管紧张素受体at-1抑制剂能够降低糖尿病血管并发症模型vcam的高表达［14］；而tnf-α诱导vcam高表达作用是通过pkc通路及氧化应激所介导的［15］。因而我们设想葛根醇提物下调svcam-1、tnf-α的作用是否也有可能通过上述通路而发挥作用，有待于进一步的研究。
【参考文献】
［1］fasching p, waldhusl w, wagner of. elevated circulating adhesion molecules in niddm-potential mediators in diabetic macroangiopathy ［j］. diabetologia, 1996,39(10) :1242-1244.
［2］mackay cr, imhof ba. cell adhesion in the immune system［j］.immunol today,1993,14(3):99-102.
［3］baud l, fouqueray b，bellocq a,et al. growth hormone and somatostatin in glomerular injury［j］. j nephrol,1999,12(1):18-23.
［4］schmid-schnbein gw. the damaging potential of leukocyte activation in the microcirculation［j］.angiology,1993,44(1):45-56.
［5］carlos tm, harlan jm. leukocyte-endothelial adhesion molecules［j］.blood,1994,84(7):2068-2101.
［6］卢学勉,杨虹,叶成夫,等. 2型糖尿病患者血清sicam-1和svcam-1的检测与大血管病变的关系［j］.临床荟萃,2003,18(7):364-366.
［7］schmidt am, hori o, chen jx, et al. advanced glycation endproducts interacting with their endothelial receptor induce expression of vascular cell adhesion molecule-1 (vcam-1) in cultured human endothelial cells and in mice.a potential mechanism for the accelerated casculopathy of diabetes［j］.j clin invest,1995,96(3):1395-1403.
［8］金惠明,刘清行,曹 翔,等. tnf-α引起的微血管内皮细胞功能障碍及其细胞分子机制［j］.微循环学杂志,2000,10(3):5-6.
［9］凌一揆.中药学［m］.上海:上海科学技术出版社,1984:29.
［10］郑俊华.生药学［m］. 3版.北京:人民卫生出版社,1999:159.
［11］郑虎占.中药药理研究与应用：第5卷［m］.北京：学苑出版社,1997:16.
［12］白红艳,邹文俊,高小平.葛根对地塞米松诱导的胰岛素抵抗的影响［j］.中国中药杂志，2004,9(4):356.
［13］张英柴,陈君柱.葛根素对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响［j］.中国中药杂志,2004,29(8):777-781.
［14］timmermans pb,wong pc,chiu at, et al. angiotensin ii receptors and angiotensin ii receptors antagonists［j］. pharmacol rev,1993,45(2):205-251.
［15］rahman a, bando m, kefer j, et al. protein kinase c-activated oxidant generation in endothelial cells signals intercellular adhesion molecule-1 gene transcription ［j］. mol pharmcol,1999,55(3):575-583.
