【摘要】  ：目的 优化更年康颗粒的醇提工艺。方法 采用正交试验设计,以芍药苷、黄芪甲苷含量为评定指标,用多指标综合评分法进行数据处理,优化提取条件。结果 更年康颗粒优化醇提工艺为18倍量70%乙醇,分3次回流提取,每次1.5 h。结论 该提取工艺合理,有效成分提取效率高。

【关键词】  更年康颗粒　芍药苷　黄芪甲苷　正交实验　综合评分法

　    abstract：objective to optimize the extraction technology for gengniankang granules. methods an orthogonal test was adopted in the study. the contents of paeoniflorin and astragaloside ⅳ were used as indices of appraisal. data processing was carried out with the multiple guidelines grading method for optimizing the extraction condition. results the optimized extraction technology for gengniankang granules was shown to be：eighteen fold volume of 70% alcohol should be added to 1 volume of the granules for 3 successive reflux extractions with 1.5 h of each. conclusion the optimized extraction technology was rational and the extraction rate of the active components was high.

　　key words：gengniankang granules；paeoniflorin；astragaloside ⅳ；orthogonal test；grading methods

  　  更年康颗粒是在《景岳全书》归肾丸的基础上,根据辨证施治原理并结合临床实践筛选出来的,由白芍、枸杞子、熟地黄、黄芪、合欢皮、淫羊藿、钩藤等9味中药组成,具有滋肾养阴、平肝宁心的功效。wwW.11665.com主要用于治疗妇女更年期潮热汗出、心烦失眠等症状。为减少药物用量及更好地发挥其功效,通过查阅文献,将方中的白芍、黄芪、合欢皮、钩藤4味药物进行乙醇提取,其余药物进行水煎煮提取。本试验就上述4味药物的醇提工艺,应用正交试验法,以芍药苷、黄芪甲苷含量为指标,采用综合评分法进行优选。

　　1  仪器与试药

  　  lc-10advp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；spd-6av紫外检测器(日本岛津公司)；美国alltech公司500型蒸发光散射检测器；hw-2000色谱工作站；电子天平(mettler toledo ag285)；kq-500e型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
   
　　芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110736- 200526)；黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号110781-200512)；中药材购自南京市药材公司,经南京中医药大学药学院生药教研室鉴定为符合2005版《中华人民共和国药典》规定药材。甲醇为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯,均购自上海化学试剂有限公司；水为重蒸水(自制)。

　　2  方法与结果

　　2.1  正交设计
  
　　方中白芍为君药,其活性成分为芍药苷,可溶于醇类；黄芪、合欢皮主要成分为皂苷和多糖类物质,且这两部分均为活性成分,工艺中采用醇提取,可兼顾两部分成分；钩藤主要活性成分为各种吲哚类生物碱,主要有钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛因碱等,其在乙醇中有较好的溶解性,为充分提高生物碱的利用率,采用醇回流提取。故根据方中这4味药的主要化学成分的理化性质,以乙醇为提取溶媒,采用l9(34)正交表进行正交设计,对乙醇的浓度(b)、用量(a)、提取次数(c)、提取时间(d),用4因素3水平进行考察,以芍药苷、黄芪甲苷含量为考察指标,进行提取工艺最佳参数的确定。其提取工艺因素水平设计见表1。按处方配比取处方药材9份,每份45 g,按照因素水平表操作,加入乙醇,加热回流,过滤后将所得的滤液减压浓缩成稠膏。表1  因素水平表（略）

　　2.2  考察指标的测定

　　2.2.1  hplc法测定芍药苷含量 

　　色谱条件：采用依利特hypersil ods色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速：1 ml/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。

   　 线性关系考察：精密吸取0.601 mg/ml芍药苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml,分别置于5 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,使浓度分别为0.060 1、0.120 2、0.180 3、0.240 4、0.300 5 mg/ml。分别吸取上述各对照品溶液20 μl,进样,按上述色谱条件测定峰面积值,以峰面积均值(y )为纵坐标,进样浓度(x )为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程：y＝6 223 541.78x＋38 695.056,r＝0.999 8(n＝5)。结果表明,芍药苷在0.060 1～0.300 5 mg/ml范围内呈良好的线性关系。
   
　　含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约0.2 g,精密称定,置离心管中,精密加入稀乙醇20 ml,称定重量,超声处理1 h,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得芍药苷供试品溶液。吸取20 μl,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点法计算,测定各样品中的芍药苷含量。结果见表2。

　　2.2.2  hplc-elsd测定黄芪甲苷含量 

　　色谱条件：采用依利特hypersil ods色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(79∶21)；流速：1 ml/min；elsd漂移管温度：90 ℃；雾化气流速：2.20 l/min。
   
　　线性关系考察：精密吸取1.306 mg/ml黄芪甲苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml,分别置于5 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,使浓度分别为0.130 6、0.261 2、0.391 8、0.522 4、0.653 0 mg/ml。分别吸取上述各对照品溶液20 μl,进样,按上述色谱条件测定峰面积值,以峰面积均值的对数值(y )为纵坐标,进样量的对数值(x )为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程：y＝0.941 6x＋5.720 8,r＝0.999 6(n＝5)。结果表明,黄芪甲苷在2.612～13.06 μg范围内呈良好的线性关系。
   
　　含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约4 g,精密称定,加水10 ml,超声溶解30 min,用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次40 ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 ml,弃去氨试液,正丁醇液蒸干。残渣加蒸馏水5 ml使溶解,放冷,通过d101型大孔树脂柱(内径1.5 cm,长12 cm),以水50 ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 ml洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中,甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点对数方程法计算,测定各样品中的黄芪甲苷含量。结果见表2。

　　2.3  实验结果
   
　　按照l9(34)正交设计表的条件进行实验,分别测得芍药苷、黄芪甲苷的含量。将结果用多指标试验全概率方法进行数据处理,具体运算及公式相关符号的意义可参考文献[1]。根据各指标影响作用的大小,本试验按其重要程度之比为m1∶m2＝芍药苷权重∶黄芪甲苷权重＝0.6∶0.4,计算p(aj)及各指标的p(b?/aj)＝xij/sj,则综合评分(m)＝p(bi)2＝p(a1)p(b?/a1)＋p(a2)p(b?/a2)＝0.6 xi1/s1＋0.4 xi2/s2。在上述各式中bi为第i号试验,aj为第j个指标。xij表示第j个指标下的第i个测定值,以sj表示第j个指标下各次(n次)试验结果的和。i＝1, 2……n；j＝1,2……k。数据处理和方差分析见表2、表3。表2  正交试验结果（略）表3  方差分析（略）注：f0.05(2,2)=19.00,f0.01(2,2)=99.00
   
　　结果表明,a、b、c、d对试验结果均无显著影响。经直观比较分析,同时结合生产实际,综合比较,确定最优工艺条件为a2b3c3d2 ,即18倍量70%乙醇,分3次回流提取,每次1.5 h。

　　2.4  最佳工艺验证

   　 取处方药材3份,根据筛选得到的提取工艺a2b3c3d2,进行正交验证试验,得芍药苷含量为1.51%,rsd＝1.51%(n＝3)；黄芪甲苷含量为0.061%,rsd＝1.97%(n＝3)。可见,按优化工艺进行提取,芍药苷、黄芪甲苷均取得较理想的结果。表明该工艺稳定可行。

　　3  讨论

 　   当处方中有多味药材时,其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差,用不同种类的成分作为评判指标其结果才有较广泛的代表性。但由于不同药材中的成分含量有时不在同一数量级,直接累加则使数量级大的对结果的贡献大,而小的贡献小,常不符合组方原则及治则。用多指标正交试验进行工艺优选时,首先需解决指标间量纲不一致和指标间的相容与否的问题,然后需针对指标间的重要性差异给出各指标权重,综合评分后再进行统计分析。在应用此法时,如何设置指标的权重,需根据具体情况具体分析。本方剂需进行醇提的各味药物中因白芍为本方君药,同时黄芪的皂苷类成分在疗效上都将发挥重要作用,故将二者的权重定为0.6∶0.4。

   　 在进行芍药苷含量测定时,由于本处方醇提部分含有4味药,样品中含有一些极性小的物质在样品测定时不易从色谱柱上洗脱,连续进样易造成芍药苷位置附近有杂质干扰,甚至会出现肩峰,影响其分离效果,因此,提取时需对样品进行净化处理,如可以采用乙醚进行脱脂处理,还可以在样品测定时经常用乙腈或纯甲醇对色谱柱进行冲洗,以除去弱极性物质,保证样品的重现性和色谱的分离性能。在对黄芪甲苷进行hplc-elsd含量测定中,为了保证色谱条件的稳定性和可重现性,除了雾化器的气体流量、流动相的流速、漂移管的温度对其有决定性影响之外,试验还发现操作环境的湿度对色谱的重现性和分离性能也有重要影响,故还需注意hplc-elsd操作环境的湿度。

【参考文献】
  　　[1] 魏 毅,罗杰英.用多指标试验全概率评分法研究茶多酚颗粒制备工艺[j].中国中药杂志,1999,24(5)：279－281.