作者：黄志华，李良东，黎晓，张生枝， 熊丽娇，曾靖
【摘要】 目的研究拳参正丁醇提取物(pbna)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤时no及nos活性的影响。方法sd大鼠随机分成4组：假手术组、视网膜缺血再灌注模型组、低剂量及高剂量pbna治疗组。假手术组分离颈总动脉后舌下静脉给予1 ml·kg-1的ns，其余各组分别在夹闭颈总动脉前分别舌下静脉注射生理盐水、低剂量(0.3 mg·kg-1)及高剂量(1 mg·kg-1)的pbna。颈总动脉夹闭1 h再灌注1 h后，视网膜电流图(erg)检查，取血，分离血清，测定血清no含量、t-nos、inos及enos的活性。结果与假手术组相比，模型组erg幅度明显降低(p<0.01)、血清no含量降低(p<0.001)、inos活性升高(p<0.05)、enos活性降低(p<0.05);与模型组比较，pbna低剂量组no含量升高(p<0.05)、inos活性降低(p<0.05)，低剂量组及高剂量组erg幅度升高(p<0.001)、t-nos(p<0.01)及enos(p<0.05，p<0.01)活性均升高。结论pbna可通过提高t-nos和具有保护作用的enos活性，降低具有损伤作用的inos的活性，升高no含量，提高抗氧化能力和扩血管功能，对视网膜功能起保护作用。Www.11665.cOM
【关键词】 拳参正丁醇提取物; 视网膜缺血再灌注损伤; 一氧化氮合酶
abstract：objectiveto investigate the effect of polygonum bistorta l. n-butyl alcohol (pbna) extract on the no content and nos activity in ischemia/reperfusion (i/r) injury in the rat retina. methodsthe rats were randomly divided into four groups: control group, retinal i/r injury group, low-dosage pbna treated group and high-dosage treated pbna group. the control group was injected with 1 ml·kg-1 ns through sublingual vein after cca was dissociated. other groups were treated with normal saline or pbna before occlusion of cca. after occlusion of cca for 1 hour following reperfusion for 1 hour, electroretinogram (erg) was surveyed, and serum was separated to determine the content of no, the activities of t-nos, inos and enos.results(1) the amplitude of erg in i/r group showed lower values than that in control group (p<0.01) and two dosage pbna treated groups (p<0.001). (2) the amplitude of erg and content of no in i/r group showed lower values than those in control group (p<0.001) and low-dosage pbna treated group (p<0.05). (3) the activities of t-nos in both low-dosage pbna group and high-dosage group were increased, compared with i/r group (p<0.01). (4) the activity of serum inos in i/r group was incerased compared with control group (p<0.05) and low-dosage pbna treated group evidently (p<0.05). (5) the activity of serum enos in i/r group was decreased compared with control group (p<0.05), both low-dosage (p<0.05) and high-dosage pbna (p<0.01) treated groups markedly. conclusionpbna has therapeutic effect on retinal ischemia/reperfusion injury by increasing the activities of t-nos and enos, decreasing the activity of inos, elevating the content of no, enhancing the anti-oxidation and dilating the blood vessel.
key words：polygonum bistorta l. n-butyl alcohol extract; retinal ischemia/reperfusion injury; nos
视网膜缺血再灌注损伤是目前临床上常见的眼病，主要发生于视网膜中央动静脉栓塞、急性闭角性青光眼、糖尿病性视网膜病等视网膜血管阻塞所引起的缺血性眼病，表现为许多缺血性眼病患者在血液再通后，视网膜损伤严重，视功能反而进一步下降。视网膜缺血再灌注损伤是多因素综合作用的结果，主要包括钙离子超载[1]、自由基的大量产生[2]、兴奋毒性氨基酸的过量释放[3,4]、炎症反应[5～7]、视网膜神经细胞凋亡[8]、no含量及nos[9,10]活性改变有关。视网膜缺血损伤是致盲的一种常见多发因素，如不及时治疗，可造成不可逆性的视力丧失[11]。因此，寻找有效治疗视网膜缺血-再灌注损伤的药物有重要意义。
拳参polygonum bistora l.别名草河车，系蓼科植物的干燥根茎。具有清热、镇惊、理湿、消肿、镇痛等功效。拳参通过95%的乙醇提取后，再依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，其正丁醇萃取部分即得拳参正丁醇提取物(polygonum bistorla l. n-butyl alcohol extract, pbna)，主要成分为丁香苷、芦丁、儿茶素及mururin a[12]。本课题组前期研究表明，pbna具有扩张血管[13]、心肌缺血保护[14]等作用，本实验通过夹闭颈总动脉方法制备大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，研究pbna对视网膜的保护作用，并探讨其与no含量和nos活性的关系。
1 材料
1.1 试剂及药物拳参正丁醇提取物(polygonum bistorla l. n-butyl alcohol extract)由沈阳药科大学中医药学院植化教研室提供，实验前用双蒸水溶解后，直径为0.22 μm的水性滤膜过滤，得到其水溶性部分用于舌下静脉给药。no，t-nos，inos及enos检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。
1.2 仪器aps-2000型眼电生理仪(中国康华)，722n可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.3 动物sd大鼠购自江西中医学院实验动物中心，体质量250～280g，雄性(动物中心许可证号：2005-0001，动物合格证号：jzdw2006-076，级别：清洁级)。
2 方法
2.1 实验分组与大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型的制备雄性sd大鼠24只，体质量250～280 g，随机分成4组：假手术组、视网膜缺血再灌注损伤模型组、pbna低剂量(0.3 mg·kg-1)治疗组及pbna高剂量(1 mg·kg-1)治疗组。大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg/kg，ip)麻醉，采用夹闭左侧颈总动脉方法制备视网膜缺血再灌注损伤模型，75%消毒颈部皮肤，沿颈正中剪开皮肤、皮下组织、肌层，分离出气管前筋膜并剪开，找出颈总动脉，将颈总动脉主干用动脉夹夹闭。充分散瞳，行眼底照相，视网膜血管变细，以确定缺血形成。夹闭60 min后，松开动脉夹，记录双侧视网膜电流图(electroretinogram， erg)，再进行荧光血管造影，以确定再灌注形成。假手术组除不结扎颈总动脉外，其余步骤均与实验组相同。假手术组分离颈总动脉后舌下静脉给予1 ml·kg-1的ns，其余各组分别在夹闭颈总动脉前分别舌下静脉注射同体积的生理盐水、低剂量(0.3 mg·kg-1)及高剂量(1 mg·kg-1)的pbna。
2.2 视网膜电流图测定大鼠颈总动脉夹闭60 min，再灌60 min后，将记录电极置于下眼睑，参考电极置于耳后记录视网膜电流图，并测定其电压幅度。
2.3 血清t-nos、inos及enos活性测定再灌注60 min后，大鼠腹腔静脉取血，4℃，3 000 r/min离心10 min，取血清，-80℃保存。严格按试剂盒说明，硝酸还原酶法测定no的含量，比色法测定t-nos、inos及enos的活性。
2.4 统计学方法运用prism 4.0统计软件，对各组数据进行单因素方差分析，组间比较采用snk-q检验，p<0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 pbna对视网膜缺血再灌注损伤时erg的影响见图1，模型组erg幅度明显低于假手术组(p<0.01)，低剂量及高剂量的pbna治疗后，erg幅度明显升高(p<0.001)。
与假手术组比较，△△p<0.01;与模型组比较，***p<0.001;n=6
图1 pbna对erg的影响
3.2 pbna对视网膜缺血再灌注损伤时血清no含量的影响如图2所示，模型组的血清no含量明显低于假手术组(p<0.001)，低剂量的pbna治疗后，血清no含量升高(p<0.05)。
3.3 pbna对视网膜缺血再灌注损伤时血清t-nos活性的影响如图3所示，低剂量及高剂量的pbna治疗后，血清t-nos活性均升高(p<0.01)。
3.4 pbna对视网膜缺血再灌注损伤时血清inos活性的影响如图4所示，模型组的血清inos活性高于假手术组(p<0.05)，低剂量的pbna治疗后，血清inos活性降低(p<0.05)。
与假手术组比较，△△△p<0.001;与模型组比较，*p<0.05;n=6图2 pbna对血清no的影响与模型组比较，*p<0.01;n=6
图3 pbna对血清t-nos的影响与假手术组比较，△p<0.05;与模型组比较，*p<0.05;n=6 图4 pbna对血清inos的影响
3.5 pbna对视网膜缺血再灌注损伤时血清enos活性的影响如图5所示，模型组的血清enos活性明显低于假手术组(p<0.05)，低剂量及高剂量的pbna治疗后，血清enos活性均升高(p<0.05或p<0.01)。
与假手术组比较，△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01;n=6图5 pbna对enos的影响
4 讨论
急性闭角型青光眼急性发作、视网膜中央动脉闭塞等，可导致视网膜血流减少或中断而引起缺血损伤;当眼压降低或血管阻塞解除，视网膜血流重新恢复时又可引起视网膜组织细胞更严重的损伤[15]，这也是临床上视网膜缺血后病人视觉功能丧失的原因之一。视网膜缺血再灌注损伤是由多种因素介导的复杂病理生理过程。no作为一种自由基在许多疾病的病理过程中起重要作用。它由3种一氧化氮合酶(nos)合成，包括：神经来源型 (nnos)、内皮细胞来源型 (enos)和诱导型(inos)，这3种nos均能在视网膜细胞表达[16]。越来越多的证据表明no在视网膜的生理性修复及病理过程中发挥重要作用[17]，不同来源的no在眼缺血损伤中发挥截然相反的作用。来源于inos的no具有毒性，其对各种类型的细胞包括视网膜细胞都具有抑制和细胞毒性作用，在缺血期及再灌注期，inos被激活，造成神网膜损伤;由enos催化形成的no通过增加血流量，防止血小板聚集和白细胞黏附而对视网膜有保护作用，但在缺血早期其mrna的表达下降[18]。
本实验结果显示，视网膜缺血再灌注损伤后，血清no含量降低，inos活性升高，enos活性降低，这种结果与masanori及hangai报道的一致。pbna治疗后，可翻转这种改变，提示拳参正丁醇提取物可能通过提高t-nos和具有保护作用的enos活性，降低具有损伤作用的inos的活性，升高no含量，提高抗氧化能力和扩血管功能，对视网膜功能起保护作用。
【参考文献】
[1] torin n, akaike a, yasuyoshi h, et al. lomerizine, a ca2+ channel blocker, reduces glutamate induced neurotoxicity and ischemia reperfusion damage in rat retina[j]. exp eye res, 2000，70 (4): 475.
[2] pannicke t, uckermann o, iandiev i, et al. altered membrane physiology inmuller glial cells after transient ischemia of the rat retina [j]. glia, 2005，50 (1): 1.
[3] kwon yh, rickman dw, baruah s, et al. vitreous and retinal amino acid concentrations in experimental central retinal artery occlusion in the p rimate[j]. eye, 2005，19 (4): 455.
[4] dijk f, kraal - muller e, kamphuis w. ischemia- induced changes of amp a-type glutamate receptor subunit expression pattern in the rat retina: a real - time quantitative pcr study [j]. invest ophthalmol vis sci, 2004，45 (1): 330.
[5] yoneda s, tanihara h, kido n, et al. interleukin-1betamediates ischemic injury in the rat retina [j]. exp eye res, 2001，73 (5): 661.
[6] sanchez rn, chan ck, garg s, et al. interleukin-6 in retinal ischemia reperfusion injury in rats [j]. invest ophthalmol vis sci, 2003，44 (9): 4006.
[7] fontaine v, mohand-said s, hanoteau n, et al. neurodegenerative and neuroprotective effects of tumor necrosis factor ( tnf) in retinal ischemia: opposite roles of tnf receptor 1 and tnf receptor 2 [j]. j neurosci, 2002，22(7): rc216.
[8] oz o, gurelik g, akyurek n, et al. a short duration transient ischemia induces apoptosis in retinal layers: an experimental study in rabbits [j]. eur j ophthalmol, 2005，15 (2): 233.
[9] cheon ew, park ch, kang ss, et al. change in endothelial nitric oxide synthase in the rat retina following transient ischemia [j]. neuroreport, 2003，14 (3): 329.
[10] hangai m, yoshimura n, hiroi k, et al. inducible nitricoxide synthase in retinal ischemia - reperfusion injury[j]. exp eye res, 1996，63 (5): 501.
[11] ding jianguang, jiang deyong. protection of retinal ischemia-reperfusion injury [j]. international journal of ophthalmology, 2005，5(5): 1010.
[12] 刘晓秋，李维维，生可心，等.拳参正丁醇提取物的化学成分[j].沈阳药科大学学报，2006，23(1)：16.
[13] 李良东，黎 晓，黄志华，等.拳参正丁醇提取液对家兔胸主动脉条收缩的影响[j].中药药理与临床，2007，23(6)：53.
[14] 叶和杨，黄志华，汪秀荣，等.拳参正丁醇提取物保护大鼠心肌缺血再灌注损伤的剂量依赖性效应[j].中国临床康复，2005，39(9)：118.
[15] tsujikawa a, ogura y, hiroshiba n, et al. retinal ischemia–reperfusion injury attenuated by blocking of adhesion molecules of vascular endothelium[j]. invest ophthalmol vis sci, 1999, 40:1183.
[16] chakravarthy u, stitt aw, mcnallyj, et al. nitric oxide synthase activity and expression in retinal capillary endothelial cells and pericytes [j]. curr eye res. 1995，14: 285.
[17] goldstein im, ostwald p, roth s. nitric oxide: a review of its role in retinal function and disease [j]. vision res. 1996，36: 2979.
[18] masanori hangai, kazuaki miyamoto, kano hiroi, et al. roles of constitutive nitric oxide synthase in postischemic rat retina [j]. investigative ophthalmology & visual science, 1999，40(2): 450.
