作者：赵海龙，刘瑞，梁欣，海春旭
【摘要】 目的： 探讨维生素a，e，c(va，ve，vc)的抗氧化作用及其剂量反应关系. 方法 ： 钙沉淀法提取雄性sd大鼠肝微粒体. 采用四氯化碳(ccl4）, vc/fe2+和过氧基异丙苯(chp) 三种激发剂建立大鼠肝微粒体脂质过氧化(lpo)模型，比色法测定丙二醛(mda) 含量，观察va，ve和vc三种维生素对mda的抑制作用. 结果： va浓度在25～100 μmol/l范围时, 对三种模型中各浓度组mda的含量均有抑制作用，最高抑制率分别为(81.2±8.6)％，(98.1±13.8)％和(85.1±2.4)％，显著低于对照组（p<0.05），在chp模型中，va浓度在10 μmol/l时其mda的含量升高. ve浓度在100～1000 μmol/l范围时, ccl4和vc/ fe2+两种模型各浓度组的mda含量均显著低于对照组（p<0.05），最高抑制率分别为(62.3±5.5)％和(95.5±7.4)％ ；在chp模型中，当ve浓度在750～1000 μmol/l时其mda含量降低；最高抑制率仅为(18.7±2.1)％. vc浓度在2500 μmol/l时，三种模型的mda含量均显著低于对照组（p<0.05）；最高抑制率分别为(83.6±5.9)％，(25.0±3.0)％和(90.4±7.8)％. 结论： va，ve和vc在三个模型中均有较强的抗氧化作用，且存在一定的剂量效应关系，其中va抗氧化能力更强.
【关键词】 维生素a; 维生素e; 抗坏血酸; 抗氧化作用；脂质过氧化作用
【abstract】 aim： to study the antioxidative activities of vitamin va,ve,vc, and their dose-effect relationship. methods： spraguedawley rats were killed and the livers were removed to isolate the microsomes by calcium ion precipitation. three kinds of microsomal lipid peroxidation(lpo) models stimulated by ccl4, vc/ fe2+ and cumine hydroperoxide (chp) were built respectively. the content of malondialdehyde (mda) was determined by colourimetry to observe the inhibition rate of three vitamins to mda. results： in all models, compared with control group, the content of mda decreased significantly (p<0.05)with vitamin a in range of 25-100 μmol/l, and the highest inhibition rates of vitamin a reached （81.2±8.6）％,（98.1±13.8）％ and (85.1±2.4)％ respectively. in the chp model, the content of mda increased when the concentration of vitamin a was 10 μmol/l. in models stimulated by ccl4 and vc/ fe2+, compared with control group, the content of mda decreased significantly(p<0.05) with vitamin e in range of 100-1000 μmol/l, and the highest inhibition rates of vitamin e reached （62.3±5.5）％ and （95.5±7.4）％. and in the chp model, the content of mda decreased when the concentration of vitamin e ranged from 750 μmol/l to 1000 μmol/l, with the highest inhibition rates of only（18.7±2.1）％. in the three models, compared with control group, the content of mda with 2500 μmol/l of vitamin c decreased significantly(p<0.05), and the highest inhibition rates of vitamin e reached （83.6±5.9）％，（25.0±3.0）％ and（90.4±7.8）％. conclusion： in all models, the three vitamins investigated have effective antioxidative effects in a doseeffect relationship. but vitamin a has a comparatively stronger effect.
【keywords】 vitamin a; vitamin e; ascorbicacid; antioxidation; lipid peroxidation
0引言
维生素a，e，c(va，ve，vc)在预防肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病等方面具有重要作用，其营养和抗病作用与抗氧化作用密切关联［1-3］. 本实验主要针对三种维生素在体外微粒体脂质过氧化(lipid peroxidation，lpo)模型中的反应，避免机体复杂因素的干扰，通过测定lpo反应产物丙二醛(malondialdehyde, mda) 的含量，综合 分析 和比较va，ve，vc三种维生素抗氧化作用的强度以及剂量反应关系.
1材料和方法
1. 1材料
二级sd雄性大鼠20只，体质量180～200 g（第四军医大学实验动物中心）；dα生育酚，硫代巴比妥酸（31fiobarbituric acid，tba），过氧基异丙苯(cumine hydroperoxide, chp)，6磷酸葡萄糖(glucose 6phosphate，g6p)，6磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose6phosphate dehydmgenase，g6pd)， 3k30 型台式高速冷冻离心机（美国sigma公司）；mda标准品（德国merck公司）；辅酶ⅱ（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, nadp）（美国genview公司)；牛血清白蛋白（华美试剂公司）；抗坏血酸、硫酸亚铁和四氯化碳（cci4）等均为国产分析纯； 722型光栅分光光度计（山东高密分析仪器厂）.
1. 2方法
1.2.1大鼠肝微粒体的制备［4-5］大鼠禁食24 h，颈椎脱臼处死, 迅速取出肝脏, 用预冷的生理盐水洗去血污, 吸干称质量. 剪碎, 按5 ml/g 肝湿质量的比例加入ph=7.4 的250 mmol 蔗糖tris/hcl缓冲液, 用电动匀浆器制成匀浆. 操作全过程在0～4℃下进行. 采用钙沉淀法提取肝微粒体, -20℃保存. 用前1 ml/g 肝湿质量比例用预冷的0.15 mol/l kcl 悬浮. 蛋白含量采用lowrys法测定.
1.2.2va，ve，vc溶液的制备 ① va溶液： 取经60℃水浴的va 164.1 mg(1 mol/g)溶于10 ml 950 ml/l的乙醇中；② ve溶液：取dα生育酚215.4 mg溶于10 ml二甲基亚砜中；③ vc溶液：抗坏血酸264.2 mg溶于双蒸水中，并用0.5 mol/l的hcl和0.5 mol/l的naoh调ph至7.4. 避光保存，备用.
1.2.3微粒体vc/fe2+ lpo激发模型反应体系中的基本缓冲液为tris/hcl (0.1 mol/l, ph=7.4)与kcl (0.15 mol/l) 按2∶3比例混合配制. 把溶解好的va，ve，vc三种维生素，再分别配置成5个不同浓度剂量组. va溶液浓度为10，25，50，75，100 μmol/l；ve溶液浓度为100，250，500，750，1000 μmol/l；vc溶液浓度为100，200，500，1000，2500 μmol/l. 每个浓度设3个平行样，同时设1个空白对照及3个阳性对照（用乙醇代替va溶液，二甲基亚砜代替ve溶液，蒸馏水代替vc溶液）. 反应体系中含缓冲液1.1 ml，0.5 mmol/l feso4 0.15 ml，0.15 mol/l vc 0.15 ml，微粒体悬浮液和不同浓度的va，ve，vc溶液各0.15 ml. 37℃水浴15 min, 0.61 mol/l三氯醋酸6.0 ml终止反应, 3000 r/min离心10 min，取上清2 ml加入2 ml 0.05 mol/l tba，100℃水浴15 min，冷却, 在波长535 nm处比色，读取a值. 比色法测各组mda含量，按下列公式 计算 mda生成抑制率［7］：mda生成抑制率＝［（mda阳性对照-mda样品）/mda阳性对照］×100％.
1.2.4微粒体chp lpo激发模型缓冲液的配制、分组及实验步骤同1.2.3. 反应体系中含缓冲液1.1 ml，1 mmol/l chp 0.15 ml，微粒体悬浮液和不同浓度的va，ve，vc溶液各0.15 ml.
1.2.5微粒体ccl4 lpo激发模型反应贮备液含基本缓冲液150 ml，0.255 g g6p，0.3 mg g6pd，30 mg辅酶ⅱ（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, nadp），9 ml h2o，新鲜配制， 应用 液为储备液稀释10倍. 反应体系中含缓冲液2.2 ml，应用液0.01 ml，ccl4/乙醇（3∶100）微粒体悬液0.3 ml和不同浓度的va，ve，vc (va和ve 浓度不变，vc 浓度配置成30，60，200，800，1500 μmol/l)溶液各0.15 ml.
统计学处理：数据以x±s表示. 采用spss 12.0统计软件进行方差 分析 ，同时进行组间多重比较，多重比较采用lsdt检验.
2结果
2.1va对ccl4,chp和vc/fe2+激发的三种微粒体lpo模型的 影响 与阳性对照相比，va在微粒体ccl4 和vc/fe2+ lpo激发模型中，在各给药浓度下mda含量均有显著下降（p<0.05），随着va增高，mda含量相应降低. 其中va对vc/fe2+模型抑制作用最强，抑制率为（98.1±13.8) ％. 在微粒体chp lpo激发模型，当va 浓度在10 μmol/l 时，mda含量升高，抑制率为（-28.7±3.5）％. 当va 浓度在25～100 μmol/l范围内随着浓度的增高，与阳性对照相比较，mda含量显著下降（p<0.05，表1）. 表1va 对三种微粒体lpo激发模型的影响 （略)
2.2ve 对ccl4，chp 和vc/fe2+激发的三种微粒体lpo模型的影响与阳性对照相比，ve在ccl4 和vc/fe2+微粒体lpo模型中，在各给药浓度下mda含量均有显著下降（p<0.05）. 在ccl4 模型中，750，1000 μmol/l 两个浓度对mda含量的减少与500 μmol/l 相比较差异无统计学意义（p>0.05）. 在vc/fe2+ 模型中浓度在750 μmol/l 时，对mda含量的减少与浓度在500 μmol/l 时差异无统计学意义（p>0.05）. 在chp模型中，当浓度在100～500 μmol/l范围内时，mda含量增加，而当浓度在7500～1000 μmol/l范围内时，mda含量减少（表2）. 表2ve对三种微粒体lpo激发模型的影响 (略)
2. 3vc对ccl4，chp 和vc/fe2+激发的三种微粒体lpo模型的影响
在chp模型中，mda含量与阳性对照相比，浓度在100~200 μmol/l 范围时，显著升高（p<0.05）；浓度在500～2500 μmol/l 范围时含量显著降低（p<0.05）. 在vc/fe2+ 模型中，mda含量与阳性对照相比，浓度在100～1000 μmol/l 时显著升高（p<0.05）；当浓度在2500 μmol/l 时显著降低（p<0.05）. 在ccl4 模型中，mda含量与阳性对照相比浓度在30~60 μmol/l 范围时，含量显著升高（p<0.05）；当浓度在200~1500 μmol/l 范围内显著降低（p<0.05，表3）. 表3vc对chp和vc/fe2+激发的两种微粒体lpo模型的影响 (略)
3讨 论
微粒体是肝脏内质网中含有一系列生物学活性的组织提取物，利用该体系与lpo关系密切的特点，加入一定的自由基激发因子，可以作为 研究 自由基反应特点的模型，也可以作为筛选抗氧化剂的有效模型.
lpo反应的结果是自由基攻击多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，pufa)裂解生成mda等终产物，因此测定mda含量能较好地反映lpo的水平. 本研究采用的三种微粒体lpo模型分别代表了不同的激发体系. 通过测定va，ve ，vc 在三种微粒体lpo模型中对mda的含量影响，比较它们的抗氧化强度.
本研究结果表明，va对ccl4 和vc/fe2+，活化的lpo有较强的抗氧化作用，提示其作用主要与抑制ccl4和vc的生成有关. 对chp 活化的lpo和超氧阴离子自由基的拮抗效应也不弱，当在低浓度10 μmol/l 时，抑制率出现负值(-28.7±3.5)，说明mda含量较对照组升高，表现出促氧化的作用，随着浓度的升高，mda含量相应减少，表现出较强的抗氧化作用. ve的抗氧化作用与va相似，所不同的是ve在浓度较低时参与chp活化的lpo的刺激作用，使mda含量增加；当ve浓度增高时所呈现的抗氧化作用依然较弱. vc对微粒体lpo的影响与反应体系中fe2+含量有关，vc/fe2+、构成的激发对可活化微粒体lpo, 当加入一定剂量fe2+时，一部分vc就会与之共同起lpo活化作用，因此只有加大vc浓度至一定水平时才会克服其与fe2+活化的lpo. 同样，在其它体系中低浓度vc有轻度的lpo刺激作用，也与反应体系中存在微量fe2+或其它2价离子有关，这就是vc对微粒体lpo的影响呈“双向作用”的主要原因之一，也是vc在不同体系中活性差别的原因所在. 这一结果提示，在实际应用或接近生理条件下的vc剂量范围内，当有一定剂量的铁存在时，vc与铁构成自由基激发对，具有刺激组织细胞mda生成作用.
综上所述，va，ve ，vc三种维生素在三个模型中均有较强的抗氧化作用，存在一定的剂量效应关系，且va 抗氧化能力更强.
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