作者：刘书文, 哈小琴, 吕同德, 张有成, 刘斌
【摘要】 目的: 通过对乙酸性胃溃疡大鼠口服携带肝细胞生长因子(hgf)基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌(st)后检测胃溃疡愈合情况及局部和cd34蛋白表达的 研究 , 探讨基因药物sthgf对乙酸性大鼠胃溃疡的 治疗 作用. 方法 : 建立乙酸性胃溃疡大鼠77只, 并随机选出5只, 给予携带绿色荧光蛋白(gfp)基因的st后观察gfp在大鼠胃壁中的分布, 剩余大鼠随机分为3组(n=24)：sthgf治疗组, st治疗组, nahco3对照组; 增菌后各组动物于造模第2日起灌胃相应药物, 隔日一次, 分别于给药后7, 14, 21 d取胃溃疡组织行he病理组织学观察, 免疫组化法检测cd34蛋白的表达. 结果: 给药后7 d光镜下溃疡部位黏膜消失, 局部有大量坏死组织, 各组胃黏膜上皮爬行不明显; 给药后14, 21 d, sthgf组黏膜上皮增生较另两组快(p＜0.01); 给药后7, 14, 21 d, cd34蛋白在sthgf组的表达高于另两组 (p＜0.05), 组间有统计学差异. 结论: sthgf可促进实验性大鼠胃溃疡黏膜上皮修复和溃疡面血管增生, 加快溃疡愈合.
【关键词】 疫苗,减毒; 沙门菌,鼠伤寒; 胃溃疡; 愈合; 肝细胞生长因子; cd34
【abstract】 aim: to investigate the effect of the attenuated salmonella typhimurium (st) with hgf gene on acetic acidinduced rat gastric ulcer and the expressions of the healing of cd34 in the ulcer. methods： seventyseven acetic acidinduced gastric ulcer rat models were established, and 5 rats were randomly selected out to observe the distribution of green fluorescent protein (gfp) in the gastric tissue, then the remaining rats were randomly divided into 3 groups (n=24): sthgf treatment group, st treatment group and nahco3 control group. rats of each group were respectively given sthgf, stgfp, st and 1×105 mg/l nahco3 every other day orally. histopathological examination of the ulcer tissue was performed by he staining and the expressions of cd34 were detected by immunohistochemical method with sabc kit on day 7, 14 and 21 after administration. results: on day 7, gastric mucosa disappeared in ulcer site, a great of necrotic tissue was found, and gastric epithelium crawling was not obvious. on day 14 and 21, epithelium proliferated more quickly in sthgf group than in other 2 groups (p<0.01). the expression of cd34 protein in sthgf group was significantly higher than that in the other 2 groups (p<0.05). conclusion: the attenuated salmonella typhimurium carrying hgf gene could promote gastric mucosa repair and new vascular formation, thus accelerating the healing of ulcers in experimental rats.
【keywords】 vaccines, attenuated; salmonella typhimurium; stomach ulcer; healing; hepatocyte growth factor; cd34
0引言
减毒鼠伤寒沙门氏菌(attenuated salmonella typhimurium, st)是一种良好的口服dna载体. 研究发现, 在体内, st可以将编码外源基因的真核质粒递呈入抗原递呈细胞(如巨噬细胞、树突状细胞等), 并在其中表达及释放［1］. 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, hgf)不仅刺激胃黏膜上皮和溃疡面微血管内皮的增殖、运动, 加速溃疡的愈合, 而且能够抑制肝［2］、心［3］、肺［4］等纤维化组织中转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, tgfβ1)的产生和增强胶原酶的活性, 这提示 应用 外源性hgf可能抑制胶原的合成和沉积, 减少愈合后的溃疡瘢痕, 防治溃疡瘢痕性幽门梗阻的发生, 有利于改善胃溃疡预后. 因此我们对口服携带hgf基因的st的实验性胃溃疡大鼠的溃疡愈合进行了观察.
1材料和方法
1.1材料
wistar雄性大鼠77只(甘肃省中医学院动物实验中心提供), 体质量200~250 g, 为spf级; 单纯减毒鼠伤寒沙门氏菌(st), 携带hgf基因的st(sthgf)和携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)基因(位于hgf的基因等位点)的st(stgfp)均为兰州军区兰州总 医院 实验中心构建; lb培养液(英国oxid公司); 兔抗大鼠cd34多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司); 链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶免疫组化超敏试剂盒(sp)及dab显色剂(santa cruz公司).
1.2方法
1.2.1造模实验前大鼠禁食24 h, 自由饮水. 实验时以30 g/l戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内给药麻醉后固定, 常规消毒大鼠腹部皮肤, 上腹部正中切口长2.0 cm, 打开腹腔, 暴露术野, 微量注射器在大鼠胃窦前壁浆膜下(进针0.5 mm以防止乙酸漏出)注入30 μl的纯冰乙酸后依次缝合腹壁各层组织.
1.2.2分组、给药及病理观察建立大鼠模型77只, 并随机选出5只, 给予stgfp用于检测gfp在胃壁中的分布, 72只大鼠随机分成3组(n=24): sthgf治疗组, st组和碳酸氢钠(nahco3)对照组, sthgf, stgfp和st菌株在lb培养液中37℃摇菌过夜活化并在sthgf组中加入丁胺卡那霉素50 μl (sthgf对丁胺卡那霉素有抗性), 次日扩大培养约16 h(10 ml lb液中加相应活化的菌100 μl), 在a525 nm波长测值 计算 菌量, 菌液离心去上清后用1×105 mg/l nahco3重悬菌体, 调整细菌数为2×109 cfu/ml, 每只0.5 ml, nahco3组给1×105 mg/l nahco3 0.5ml, 自术后第2日起隔日给药一次, 直到取标本; 除stgfp组5只于给药7 d后全部取标本外, 其余三组分别于给药后7, 14, 21 d各8只取溃疡及周围3 mm正常胃黏膜组织行40 g/l 甲醛固定, 用圆规测量溃疡凹陷的中心, 石蜡包埋时平行于胃大弯通过溃疡凹陷的中心切组织块固定; 分别进行he染色观察各期病理变化, 并在光镜(×100)下用微测量尺测量胃黏膜上皮的爬行长度(以较长一侧为准).
1.2.3免疫组化染色兔抗大鼠cd34多克隆抗体工作液浓度分别是1∶100; 常规石蜡包埋切片, 厚4 μm, 采用sp法, 免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行; 阳性对照采用自身对照, 用磷酸盐缓冲液代替一抗进行阴性对照; cmet 和cd34 均采用高温高压抗原修复.
1.2.4结果判定通过染色计算微血管密度(microvessel density, mvd)以判断cd34的表达水平. 先用40倍光镜扫视整个切片, 寻找高血管密度区, 即“热点”. “热点”一般位于新生黏膜与溃疡裸区移行处及与肝粘连处, 参照 文献 ［5］方法计数.
统计学处理: mvd以x±s表示, 组间差异比较用单因素方差 分析 及bonferroni法, p<0.05为有统计学意义, 所有数据应用spss 12.0软件包处理.
2结果
2.1大体肉眼观察给药后7 d时各组呈明显凹陷性溃疡, 溃疡面被覆坏死组织, 浆膜侧均与肝粘连, 溃疡底部组织既薄又脆, 稍不慎溃疡底部被撕裂穿孔, 溃疡直径1.0~1.4 cm; 14 d时溃疡面明显红润, 肉芽组织增生, 少量黏膜上皮覆盖溃疡面, 溃疡面皱缩; 21 d时溃疡面有大量黏膜上皮覆盖, 正常黏膜与新生黏膜界限尚清, 溃疡面明显缩小, 但溃疡凹陷仍明显.
2.2大鼠溃疡形成及愈合给药后7 d溃疡病灶与溃疡边缘有明显分界, 溃疡部位黏膜消失, 可见侵犯黏膜全层并深达黏膜肌层或更深的坏死性病变, 并可见中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等大量的炎性细胞, 溃疡边缘黏膜腺体间质充血水肿, 各组给药后7 d溃疡边缘黏膜底部向溃疡面像“7”样凸起(图1a), 并向溃疡面皱缩, 黏膜上皮增生不明显未测量; 给药后14 d坏死组织逐渐脱落, 可见大量新生的肉芽组织, 溃疡边缘黏膜腺体呈囊性扩张且顶端向溃疡低部倾斜(图1b); 给药后21 d可见新生的腺体覆盖溃疡及增生的纤维结缔组织, 黏膜层变薄, 黏膜下层和肌层增生增厚, 原溃疡处与周围黏膜分界仍清楚, 增生黏膜腺体明显扩张(图1c). 除sthgf组给药后7 d只做胃黏膜的荧光分布观察(图d)外, 其余各组给药后14, 21 d用微测量尺测量胃黏膜上皮爬行长度并统计 分析 , sthgf组与另两组间差异有统计学意义(p<0.01), st组与nahco3组间差异无统计学意义(p>0.05, 表1).表114, 21 d各组新生黏膜长度 (略)
2.3免疫组织化学cd34 治疗 后7, 14, 21 d, 主要在新生黏膜与溃疡裸区移行处及与肝粘连处细胞胞质和胞膜中表达, 呈棕褐色(图2); sthgf治疗组与st组和nahco3组间差异有统计学意义(p<0.05), 而st治疗组与nahco3组间无统计学意义(p>0.05, 表2).表2cd34标记的mvd表达 (略)
3讨论
hgf是一种多功能的生长因子, 通过自分泌、旁分泌以及经典的轴突逆向运输的方式, 与特异的cmet受体结合而起作用, 二者结合后能启动多种细胞内信号旁路包括mapk磷脂酰肌醇激酶(p13k)和stat3［6］; 最终能够刺激多种上皮、内皮和间质细胞的生长, 血管生成［7］, 促进细胞增殖; hgf与cmet作用后可能使尿激酶类纤溶酶原激动剂及其受体表达上调, 它可直接作用于内皮细胞, 使其增生和迁移; 由于cmet在不同细胞、不同分化阶段作用的底物不同, 使其在特定的条件下表现出多种功能: 促进肝细胞、内皮细胞和黑色素细胞的分裂; 引起上皮细胞的迁移, 在胚胎发育过程中控制细胞的移动, 诱导细胞形态变化及血管内皮生长因子(vegf) 和il8的产生, 促进血管生成; gerritsen等 ［8］提出hgf和vegf协同起来能发挥更强的促增殖、化学趋化作用, 可以促进内皮细胞的存活、血管管状结构的形成.
cd34的主要功能是在细胞间起到黏附作用, 是显示血管内皮细胞间黏附作用的最佳指标, 被认为是重复性较好的血管内皮细胞标记物, 本试验中cd34的表达在携带hgf基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌组较单纯鼠伤寒减毒沙门氏菌组和碳酸氢钠组高, 有统计学意义.可见, hgf具有促进血管生成作用.
由于hgf蛋白半衰期极短［9］, 容易降解, 给药不方便, 而且成本高; 所以我们利用st作为基因传递载体的优势及对肠黏膜组织强嗜性的特性, 将hgf基因的真核表达载体转入st中, 制备成一种以st为细菌载体的基因治疗药物(sthgf), 培养sthgf成本低, 繁殖快; 而编码外源基因的真核质粒递呈入抗原提呈细胞, 外源基因在其中表达并持续释放, 从而有利于疾病的治疗.
乙酸性胃溃疡是一种机械性慢性溃疡, 而hgf刺激多种上皮、内皮和间质细胞的生长, 血管生成, 使溃疡表面更快地黏膜化, 从而加速溃疡的愈合.
【 参考 文献 】
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