【关键词】 bet-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(δψm)；细胞凋亡；过钒酸钠 摘要： 目的 研究酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠（pervanadate，per）对电离辐射作用后细胞线粒体膜电位(δψm)改变和细胞凋亡的影响。方法 应用流式细胞仪测定电离辐射作用后鼠源性髓系白血病细胞株bet-2细胞线粒体膜电位及其在过钒酸钠干预后的改变和细胞凋亡水平。结果 电离辐射早期可引起bet-2细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞凋亡发生；过钒酸钠在一定程度上稳定细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡。结论 过钒酸钠可逆转电离辐射诱导的细胞线粒体膜电位的降低，减少造血细胞凋亡的发生。
关键词： bet-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(δψm)；细胞凋亡；过钒酸钠
effects of pervanadate on mmp of bet-2 cells induced by ionizing irradiation
yang long,wang yi-ping,rong shu,et al.
institute of military medical research center of nanjing military district (nanjing 210002,china)
abstract： objective to study the effects of pervanadate(per),the inhibitor of protein tyrosine phosphotases on the alterations of mitochondrial membrane potential(mmp)and the apoptosis of bet-2 cells induced by ionizing irradiation.methods bet-2 cells were divided into per-treated groups and non-per groups and incubated after ionizing irradiation.the mmp and apoptosis were measured with fcm.results after irradiation was given,the mmp of bet-2 cells was reduced in the early stage significantly,and the apoptosis appeared,and these changes had a dose-dependent pattern and a time-course fashion.per potently enhanced the mmp of bet-2 cells and prevented irradiation-treated cells from apoptosis.conclusion per reversed the repression of mitochondrial membrane potential and suppress apoptosis induced by ionizing irradiation in the hematopoietic cells.
key words： bet-2 cell;ionizing irradiation;mitochondrial membrane potential(mmp,δψm);apoptosis;pervanadate(per)
细胞凋亡是电离辐射导致造血系统损伤的主要方式。wwW.11665.com预防与控制造血干/祖细胞大量凋亡，有效恢复机体造血功能，在未来可能爆发的核事故、核战争以及肿瘤放射治疗副反应控制等领域都具有十分重要的意义〔1〕。造血细胞信号转导过程受蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotases，ptp）的调控〔2〕。过钒酸钠（pervanadate，per）作为ptp特异性抑制剂，参与细胞内多条信号通路信息的传递过程的调节〔3〕。通过改变ptp活性调控造血细胞受体信号转导通路，可能成为继重组人粒细胞集落刺激因子（g-csf）、促红细胞生成素（epo）、重组血小板生长因子（tpo）等细胞因子之外的促进辐射造血损伤修复的发展方向〔4〕。本研究观察per对照射后bet-2细胞线粒体膜电位改变及细胞凋亡的影响，探讨调控造血细胞受体信号通路中ptp活性对造血细胞电离辐射损伤的保护作用。结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 bet-2细胞 bet-2细胞为促红细胞生成素（epo）依赖的鼠源性髓系白血病细胞株(军事医学科学院第3研究所张明伟惠赠)。悬浮于含10％马血清的1640完全培养基中，加入epo至终浓度为2u/ml，置37℃，5％co2孵箱培养，隔日换液，取指数生长期细胞用于试验。
112 主要试剂与仪器 罗丹明123、四甲基偶氮噻唑蓝(mtt,美国sigma公司)。原钒酸钠（navo3）、双氧水（h2o2）：用双蒸水配制为200mmol/l的储存液，过滤除菌，4℃保存。促红细胞生成素（epo）活性为1×105u/mg，纯度>95％，由北京放射医学研究所汤仲明教授提供。model 450型酶联仪（美国bio-rad公司）；facscalibur型流式细胞仪（美国becton dickson公司）。
12 方法
121 照射条件 军事医学科学院放射医学研究所60coγ射线照射源，一次照射剂量分别为3，5gy，剂量率为148～157gy/min。
122 per制备〔5〕 将200mmol/l原钒酸钠50μl及200mmol/l h2o250μl加入400μl 1640培养液中，21℃水浴反应15min，加入5μlh2o2酶终止反应。用1640培养液稀释成应用液现配现用。
123 mtt方法 将待测细胞用rpmi 1640培养液洗涤3次，台盼兰染色计数活细胞，用上述完全培养基分为无per组及per实验组（per终浓度为5μmol），调整细胞浓度至3×105/ml，每孔100μl加入96孔板中；per用rpmi 1640递减稀释后，每孔加入100μl，每组做3个复孔，37℃培养48h，加mtt(50mg/ml)20μl，继续培养4h，离心，弃上清，加入200μl二甲基亚砜（dmso），振荡助溶，在model450酶联仪上测492，630nm双波长的a值，以per浓度指数为横坐标，以a值纵坐标绘图。应用origin version294软件中logistic程序进行拟合处理分析。
124 细胞线粒体膜电位(△ψm)测定〔6〕 取1×105细胞，pbs洗涤2次，加入罗丹明123储存液至终浓度为10μmol/l，室温下平衡30min，pbs洗涤3次，pbs稀释至细胞浓度为1×105/ml，上机检测，激发光波长为488nm，计数1×104个细胞，测定细胞相对荧光强度，数据经流式细胞仪kolmogorov-smirnov statistic
s软件进行结果分析。
125 细胞凋亡检测 按德国宝灵曼公司annexin-v-fluos凋亡分析试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，pbs洗涤，200g×5min，弃尽上清，重悬于100μlannexin-v-fluos标记缓冲液［1000μl溶液ⅲ中预先加入20μlannexin-v-fluos单抗及20μl50μg/ml溴化丙锭(pi)］中，避光，室温放置10～15min，加溶液ⅲ(100mmolhepes/naoh,ph74,140mmolnacl,5mmolcacl2)04ml，上机检测。
2 结果
21 bet-2对epo细胞增殖反应性（图1） 培养基中epo浓度<05u/ml时，bet-2细胞增殖停止；在1～2u/ml之间即有良好促增殖作用；epo浓度>4u/ml，其促增殖能力已达饱和。表明bet-2细胞对epo有较好的依赖性，保持了稳定的生物学特性。
图1 bet-2对epo的增殖反应性（略）
22 per对bet-2细胞增殖反应性（图2） 当per浓度<005μmol/l时，对细胞无明显效果；per≥625μmol/l时，导致细胞死亡；而在1～3125μmol/l时可明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖。提示适量per具有细胞因子样作用，可促进bet-2细胞增殖。因此，在下述实验中，使用per的终浓度为5μmol/l。
图2 bet-2对per的增殖反应性（略）
23 per对电离辐射所致bet-2细胞增殖抑制的影响（图3） 对于未照射的bet-2细胞，适当浓度per可明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖；对于5gyγ射线照射后的bet-2细胞，1～3125μmol/l的per仍能明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖。提示电离辐射可能导致细胞信号转导过程中负调控―酪氨酸磷酸酶作用的增强，抑制细胞的增殖。
24 per对电离辐射后bet-2细胞mmp改变的影响 未处理的bet-2细胞相对荧光强度为18111±899，3gy照射细胞相对荧光强度为16420±870，5gy照射细胞相对荧光强度为13093±910，组间比较差异均有统计学意义(p<001)，表明随着照射剂量增加，细胞线粒体膜电位(△ψm)呈逐渐下降的趋势。5gy照射12h后细胞相对荧光强度为10263±856，而照射即刻加入per（终浓度为5μmol/l），细胞相对荧光强度为16837±915(未处理的bet-2细胞相对荧光强度为18359±1422)，组间比较差异有统计学意义(p<001)，表明per可明显缓解照射后bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降的程度。
25 per对电离辐射后bet-2细胞凋亡的影响 5gy照射后12h,存活细胞（ll象限）比例为6729%,凋亡及坏死细胞（ul+ur+lr象限）达到3271%；照射后即刻加入per（终浓度为5μmol/l）,存活细胞9343%，凋亡及坏死细胞仅为657%，组间比较差异有统计学意义（p<001），表明per可显著减少照射后bet-2细胞凋亡的发生。
图3 照射前后bet-2细胞对per增殖反应性（略）
3 讨论
研究表明,凋亡细胞在表现出明显的核凋亡之前，线粒体失去其跨膜电势-线粒体膜电位（mmp），这种膜电位的崩解出现在许多类型的细胞中。线粒体膜电位的改变是细胞凋亡效应阶段前的一个重要标志〔6,7〕。本研究结果表明,电离辐射可导致鼠源性epo依赖的bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。而在照射后即刻加入适量ptp特异性抑制剂per，则可明显缓解受照后bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降趋势，显著减少电离辐射诱导的细胞凋亡，有效促进受到辐射损伤bet-2细胞的存活、增殖。per对辐射损伤后的bet-2细胞有一定的保护作用。结果提示，电离辐射可能直接或间接地激活了蛋白质酪氨酸磷酸酶(ptp)负调控过程，从而引发造血细胞受体增殖信号抑制，导致细胞线粒体膜电位(△ψm)下降，可能是辐射诱导细胞凋亡的机制之一〔8〕。
参考文献
〔1〕 罗庆良，从玉文，郝 静，等.造血因子与急性放射病［j］.解放军医学杂志，2005，30（3）：186-190.
〔2〕 cohen j，oren-young l，klingmuller u，et al.protein tyrosine phosphatase 1b participates in the down-regulation of erythropoietin receptor signalling［j］.biochem j，2004，377(pt 2):517-524.
〔3〕 tonks nk.redox redux:revisiting ptps and the control of cell signaling［j］.cell，2005 ，121(5):667-670.
〔4〕 lawson ae，bao h，wickrema a，et al.phosphatase inhibition promotes antiapoptotic but not proliferative signaling pathways in erythropoietin-dependent hcd57 cells［j］.blood，2000 ，96(6):2084-2092.
〔5〕 从玉文，陈家佩，邵源.辐射后造血细胞对造血因子增殖反应性变化的研究〔j〕.军事医学科学院院刊，1999，23（2）：119-122.
〔6〕 张海涛，张海风，祝其锋，等.鲎血细胞多肽诱导hl-60细胞凋亡时线粒体膜电位的变化〔j〕.
