【摘要】 目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对前列腺癌lncap细胞her2信号通路的影响，探讨其抗肿瘤作用的分子机制。方法 四甲基偶氮唑蓝(mtt)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响；hoechst 33342染色观察细胞凋亡的形态学变化，western blot检测凋亡标志蛋白、her2/ neu、phosakt、phoserk等信号蛋白的表达。结果 丁酸钠能够有效抑制lncap细胞的增殖并诱导细胞凋亡，半效杀伤剂量（ec50）为5.6mmol/l；药物能够抑制her2基因的转录和蛋白的表达，并抑制下游信号通路中mapk和akt的活化。结论 丁酸钠能够阻断对前列腺癌细胞生长具有重要作用的her2信号通路，从而对肿瘤细胞发挥抑制作用。
【关键词】 丁酸钠；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；前列腺癌；her2；细胞信号通路；凋亡
targeting her2 signal pathway in lncap prostate cancer cells by sodium butyrate
hao tongli,xiao xuren,guo gang,zhu jie
department of urology,pla general hospital,beijing 100853，chinaabstract：objective to investigate the mechanisms underlying the antitumor effect of histone deacetylase inhibitor sodium butyrate on lncap prostate cancer cells.methods proliferation of lncap cells exposed to sodium butyrate was detected by mtt assay. cell apoptosis was assayed by hoechst 33342 nuclei staining as well as apoptosis marker protein leaved parp expression. the expression of her2 as well as downstream key signaling molecules was assayed by western blotting after sodium butyrate exposure.results sodium butyrate killed lncap cells with an ec50 value of 5.6mmol/l within 48 hours as well as inducing cell apoptosis. sodium butyrate could downregulate her2 expression through suppression of her2 gene transcription.activation of downstream signaling molecules such as akt and erk were also suppressed.conclusion sodium butyrate exhibits significant antitumor effect against lncap cells through suppression of her2 signaling pathway.
key words：sodium butyrate; histone deacetylase inhibitor; prostate cancer; her2; cell signaling pathway; apoptosis
丁酸钠是膳食纤维在肠道中酵解后产生的主要短链脂肪酸，具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂活性，主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，参与多种基因的表达。WWw.11665.COM动物实验及临床实验显示，丁酸钠可以抑制多种肿瘤细胞生长，诱导细胞成熟分化，诱导癌细胞发生凋亡，达到治疗肿瘤的目的[1]。
新近研究观察到丁酸钠对前列腺癌细胞系具有抑制效应，但是其作用机制尚不明确，这种抑制作用并非是因为对雄激素受体的清除[2]，本实验研究丁酸钠对her2信号通路的影响，探讨其对前列腺癌lncap细胞的抑制作用机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
rpmi1640、胎牛血清购于invitrogen公司；胰蛋白酶、青链霉素、l谷氨酰胺、丙酮酸钠购于hyclone公司；丁酸钠购于sigma公司，溶于pbs，-20℃保存；mtt（四甲基偶氮唑蓝）、hoechst 33342购于sigma公司；小鼠抗βactin、抗多聚(adp核糖)聚合酶降解产物（cleaved parp）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠igg均为cell signaling公司产品；bca蛋白定量试剂盒、化学发光底物购于pierce公司。rtpcr试剂盒购于takara公司。引物序列如下: her2: 5′agc cgc gag cac cca agt 3′,5′ttg gtg ggc agg tag gtg agt t 3′ [3]; oligo 6.0软件设计β2微球蛋白(β2mg)引物序列:5′ctc gcg cta ctc tct ctc ttt ctg g3′，5′gct tac atg tct cga tcc cac tta a3′。引物由上海博亚生物技术公司合成。dl600为大连宝生物公司产品。
1．2 细胞系及细胞培养
lncap细胞为本实验室保存，培养基为含10% 胎牛血清、2mm l谷氨酰胺、100u/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、1.0mm丙酮酸钠的rpmi1640,在37℃饱和湿度，5% co2 条件下培养。
1．3 细胞增殖检测
采用mtt测定法。104个细胞接种于96孔板，每孔加入5mg/ml mtt 20μl， 继续孵育5h后加裂解液，37℃过夜，震荡后以immunoskan340酶联仪540nm波长检测吸光度。每组设3个复孔。细胞存活率（%）=实验组的吸光度/对照组吸光度×100%。
1．4 凋亡的检测
细胞涂片以甲醇固定，pbs洗涤后，以hoechst 33342染色，荧光显微镜（nikon eclipse te2000u）紫外激发光下观察细胞核形态。
1．5 western blot检测
对数生长期的细胞以药物处理48h（对照组加入pbs），收集细胞后以laemmli裂解液冰浴条件下裂解细胞，获取全细胞裂解液，热变性后以bca试剂盒进行蛋白定量，取60μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后电转至pvdf膜上，以5%脱脂牛奶室温封闭1h，加一抗过夜，漂洗后加脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温反应1h，化学发光底物显色，胶片曝光。
1．6 rt pcr
按trizol试剂盒操作说明进行，提取细胞总rna进行逆转录反应，随后对her2/neu进行35个循环的pcr 扩增，反应产物以含0.1μg/μl溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶进行电泳，js380自动凝胶图像分析仪扫描。
1．7 统计学方法
概率单位法计算半效杀伤剂量（ec50）。
2 结果
2．1 丁酸钠对细胞的杀伤效应
96孔板中lncap细胞生长至对数生长期，加入按倍比浓度稀释的丁酸钠，48h后mtt检测细胞存活情况，概率单位法计算ec50为5.6mmol/l，见图1。
2.2 丁酸钠诱导lncap细胞凋亡
药物作用48h后收集细胞，hoechst 33342染色，如图2所示，丁酸钠处理组发现部分细胞胞核碎裂、染色质浓集，符合凋亡的细胞形态学改变。 lncap细胞暴露于丁酸钠48h后检测细胞凋亡的标志蛋白——parp降解产物（cleaved parp），如图2c所示，对照组parp为116kd，而药物处理48h后出现了89kd的降解产物，因此符合凋亡的生化改变。
2．3 丁酸钠对her2的影响
western blot分析显示，药物处理后her2的蛋白表达呈剂量依赖性下降，20mmol/l丁酸钠作用48h能够完全抑制her2的表达。
2．4 丁酸钠对her2基因转录的影响
rtpcr显示，10mmol/l丁酸钠作用24h始her2 mrna水平即明显下降，说明药物能够抑制her2基因的转录，见图3。
2．5 丁酸钠抑制mapk和akt活化
丁酸钠处理后，phoserk、phosakt的表达呈剂量依赖性下降,总akt无明显改变,说明药物抑制her2的表达后，其下游mapk和pi3k信号通路的关键蛋白活化（phoserk、phosakt）也受到相应抑制，见图4。
3 讨论
本研究显示，丁酸钠能够抑制lncap细胞中her2的表达，并阻断其下游的mapk和pi3kakt通路的活化，从而对细胞产生杀伤效应。
her2/neu基因(又名cerbb2) 编码的跨膜受体酪氨酸蛋白激酶，是表皮生长因子受体家族的成员，在多种肿瘤中均有高表达。正常前列腺上皮细胞低表达her2，但在前列腺癌，尤其是在雄激素非依赖性前列腺癌中表达增高［4］。her2/neu作为受体型蛋白酪氨酸激酶，能够在没有细胞外配体的情况下发生自身激活，通过mapk、pi3k/akt 通路，促进细胞增殖，获得对凋亡的抵抗能力［5,6］。此外，her2激酶信号级联的活化尚能激活雄激素受体，使前列腺癌细胞对雄激素受体的抑制具有抵抗性，在前列腺癌的雄激素非依赖性进展中发挥着重要作用［7］。
既往研究观察到丁酸钠对前列腺癌细胞具有抑制效应，但药物作用后雄激素受体的表达并无改变，说明该效应并非通过雄激素受体信号通路介导的[2]。但对于her2信号通路在其中的作用尚无研究报道。本研究首次发现，丁酸钠可有效抑制细胞内her2的表达，进而抑制其下游信号通路关键蛋白的活化，阻断mapk及pi3k/akt信号通路，从而诱导前列腺癌细胞凋亡。丁酸钠抑制her2表达的机制之一在于对her2基因转录的抑制，是否能够促进her2蛋白的降解尚不明确。由于her2在前列腺癌的雄激素非依赖性进展中发挥的重要作用，因此丁酸钠在基因转录和蛋白表达水平上对这一关键性信号蛋白表达的抑制，理论上能够为治疗雄激素非依赖性前列腺癌提供新的思路。
丁酸钠的不足之处是相对低效能(作用浓度为mmol)、血浆清除过快等，使得丁酸钠的临床应用受到一定限制。人们开发了低毒性及更具特异性的衍生物，其中an9在 期临床实验中已显示了明确的抗肿瘤作用前景[8]。可以预见到，单独使用丁酸钠及其衍生物，或者配合去势治疗，在治疗晚期前列腺癌方面将会有更广泛的研究和应用价值。
【参考文献】
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