【摘要】 目的：采用基因克隆技术及原核表达技术重组人硫氧还蛋白（trx），并证实重组trx具有二硫键还原酶活性。方法：从人睾丸互补dna（cdna）文库克隆出人的trx cdna，采用限制性酶切方法构建pqe-32/trx原核表达质粒，并在大肠杆菌m15中进行稳定表达，应用talon 金属螯合树脂纯化重组人trx蛋白。用western印迹方法鉴定重组人trx，并检测trx的二硫键还原酶活性。结果：（1）克隆的人trx cdna序列与基因库（genebank）（x54539）序列比较，可译框架完全相同；（2）原核表达载体中含有trx cdna的全长序列；（3）经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）诱导，含质粒pqe-32/trx的大肠杆菌成功表达出人的trx；（4）活性检测证实重组trx具有二硫键还原酶活性。结论：成功构建原核表达载体pqe-32/trx，并重组出有活性的人trx蛋白，可以用于保护性研究。
【关键词】 基因；硫氧还蛋白；dna，重组
recombination of human thioredoxin protein and detection of trx activityzhang yina wu xiaowei zou ningthe second affiliated hospital, harbin medical university, harbin,heilongjiang,150086,chinaabstract：objective:to use the technology of genetic cloning and prokaryotic expression to recombinate human thioredoxin(trx) protein and verify that recombinant protein has the activity of disulfide reductase.methods:trx cdna sequence was cloned from human testicle cdna library and constructed pqe-32/trx prokaryotic expressing plasmid by the method of restriction enzyme analysis.the plasmid stably expressed the recombinant protein in eco.li(escherichia coli) m15.the proteins were purified by talon metal affinity resins and identified by western blot.the activity of disulfide reductase was detected.results:(1) comparing the sequence in the cloned human trx cdna sequences with genbank(x54539), the open reading frame was all same; (2) the pqe-32/trx prokaryotic expressing vector had the full length sequence of trx cdna;(3) eco.li having plasmid pqe-32/trx had successfully expressed human trx protein through inducion of iptg;(4) through the assay of activity，the recombinant trx protein was proved that have activity of disulfide reductase.conclusion:this study successfully construct pqe-32/trx prokaryotic expressing vector,and successfully recombine the human protein trx that have the activity of disulfide reductase.recombinant trx protein can be used to protective studies.
key words： genes; thioredoxin; dna,recombinant
硫氧还蛋白（thioredoxin，trx）作为机体内一种重要的氧化还原调节蛋白，具有多种生物学功能[1～3]。WWw.11665.cOmtrx是非常有效的自由基清除剂，能保护细胞免受诸如肿瘤坏死因子(tnf) 以及h2o2 等引起的氧化损伤。此外，trx还通过修复受损伤的蛋白、抑制凋亡和调节某些转录因子表达对细胞起保护作用。目前研究证实trx在组织的缺血再灌注损伤和神经退行性病变的防治中发挥了重要作用[4～6]。本研究试图通过基因克隆技术重组出具有生物学活性的人trx蛋白，以便进行trx的功能分析和保护性作用研究。
1 资料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株：大肠杆菌m15和jm109（购自takala公司）。
1.1.2 pgem-t easy/ trx重组质粒（从人睾丸cdna文库扩增trx基因，并与pgem-t easy克隆载体连接构建而成）：由邹宁博士提供。
1.1.3 聚合酶链式反应（pcr）引物：（1）trx扩增引物p1和p2（参考序列genebank j04026）：p1位于64-81bp，序列为 5′-atg gtg aag cag atc gag-3′；p2位于455-473bp，序列为5′-ggc aac tgg tta tgt ctt c-3′；（2） trx扩增引物p3和p4（参考pgem-teasy/trx重组质粒结构）：p3：5′-atc gag ctc aga tgg tga agc aga tcg ag-3′（含saci酶切位点），p4：5′-atc gtc gac ggc aac tgg tta tgt ctt c-3′（含sali酶切位点）。
1.1.4 原核表达载体：pqe-32 (qiagen)。
1.1.5 蛋白纯化柱：talon金属螯合树脂纯化柱（his.bind columns,novagen)。
1.1.6 限制性内切酶：saci和sali (promega)。
1.1.7 修饰酶：ex tag dna聚合酶 (takara)；t4 dna ligsae (promega)。
1.1.8 抗体：鼠抗人trx多克隆抗体（bd pharmingen）；碱性磷酸酶标记山羊抗鼠igg（promega）。
1.2 实验方法
1.2.1 人trx cdna序列检测：用引物p1和p2从pgem
○r
-t easy/ trx重组质粒中扩增人trx cdna。反应体系如下：质粒 0.1μl，p1 0.5μl，p2 0.5μl，10×buffer 2μl，三磷酸脱氧核苷（dntp） 1.6μl，extagdna聚合酶0.1μl，加水至20μl轻混，pt-100 pcr上扩增。热循环条件为：94℃ 5min； 94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，25个循环；最后72℃延伸5min。并用t7和sp6引物双向测定trx cdna序列，由博亚生物公司完成。
1.2.2 pqe-32/trx重组质粒的构建：（1）扩增带saci和sali酶切位点的trx cdna片段：用引物p3和p4从pgem
○r
-t easy/ trx重组质粒中扩增携带saci和sali酶切位点的trx cdna片段。反应体系如下：质粒0.1μl，p3 0.5μl，p4 0.5μl，10×buffer 2μl，dntp1.6μl，extagdna聚合酶0.1μl，加水至20μl，轻混，pt-100 pcr上扩增。热循环条件为，94℃ 5min； 94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，25个循环；最后72℃延伸5min。pcr产物用1.5%tae(电泳缓冲液）琼脂糖凝胶检样，回收目的片段；（2）限制性酶切反应：用限制性内切酶saci和sali切割pqe-32质粒和trx的pcr产物。反应体系及条件：saci 1μl，l buffer 2μl，质粒1μg，加水至20μl，37℃作用1.5h，加入h buffer 2.3μl，sali 1μl，37℃作用2h；（3）pqe-32/trx重组质粒的构建：用t4 dna连接酶连接pqe-32质粒和trx的酶切产物，4℃过夜。反应体系如下：质粒载体（vector） 120ng，插入（insert） cdna 48ng，10×ligase buffer 1μl，t4 dna ligase 0.3u，加水至10μl轻混，4℃连接过夜。转化大肠杆菌m15，涂氨苄青微素（amp）+卡那微素（kanamycin）抗性平板，采用pcr法筛选阳性克隆，并进行克隆测序。
1.2.3 trx重组蛋白的表达、鉴定和活性检测：将克隆得到pqe32-trx质粒转化到宿主菌e.coli.m15(内含prep4质粒)中，在含100μg/ml amp+25μg/ml kanamycin的lb培养基中，37℃振荡培养，当od600达到0.6左右时，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）至终浓度为0.5 mmol/l。37℃诱导5h。采用western免疫印迹鉴定重组蛋白，用his bind蛋白纯化柱纯化融合蛋白。
硫氧还蛋白的二硫键还原酶活性分析：在1000μl反应混合物中含有50mmol/l tris·hcl (ph 7.5), 1 mmol/l乙二胺四乙酸（edta）, 和 0.17 mmol/l 胰岛素，5.0μmol的重组蛋白。加入二硫苏糖醇（dtt）至终浓度2 mmol/l启动反应，室温下690nm处每隔1min测定1次光密度（od）值，绘制反应曲线。
2 结 果
2.1 trx cdna序列测定结果
用pcr方法从pgem
○r
-t easy/ trx重组质粒中扩增人trx cdna，并用t7和sp6引物双向测定trx cdna序列。测定结果显示，序列长度为503bp，其中包括trx cdna全长315bp（atg-taa）。将测序结果与trx基因序列genebank（x54539）比较，可译框架完全相同。
2.2 含pqe-32/trx重组质粒阳性克隆筛选
用限制性内切酶saci和sali分别酶切质粒pqe32和trx的pcr产物，用t4 dna连接酶（ligase）连接过夜，转化到大肠杆菌m15，用pcr方法筛选阳性克隆。电泳可见1、2、3、4、5、6道为阳性克隆，第7道为阴性克隆（图1）。
2.3 序列测定
对重组质粒pqe-32/trx进行序列测定，结果pqe-32/trx与pgem
○r
-t easy/trx质粒中trx cdna全长序列完全一致。扩增中使用ex tag dna聚合酶，保证了扩增序列的正确性。测定序列长度为576bp，其中包括trx cdna全长315bp（atg-taa），saci和sali酶切位点，以及质粒载体pqe-32的部分序列和6个组氨酸的编码序列。证实pqe-32/trx重组质粒构建成功。
2.4 重组trx蛋白的表达检测
将pqe-32/trx重组质粒转入大肠杆菌m15中扩增，用0.5mmol的iptg诱导。提取重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sds-page）电泳。trx含有105个氨基酸，分子量是12kd，由于表达载体的5′端带6-his标记，因此trx融合蛋白的分子量是14kd，sds-page电泳结果与预期的结果一致。电泳结果表明，随iptg诱导时间的延长trx表达量明显增加，诱导5h表达量最高。空载体无特异蛋白表达（图2）。
2.5 重组trx蛋白的表达鉴定
用iptg诱导trx表达5h，裂解细菌，提取总蛋白，采用western免疫印迹方法鉴定重组蛋白。杂交结果可见，含pqe-32/trx重组质粒的大肠杆菌经诱导表达出特异蛋白，而含空载体的大肠杆菌未诱导出特异蛋白；随诱导时间的延长trx表达量明显增加，未诱导时大肠杆菌不表达trx，诱导5h时trx表达量最高（图3）。
2.6 重组trx蛋白活性检测
在有dtt条件下trx对胰岛素a，b链之间的二硫键有还原作用。检测硫氧还蛋白的二硫键还原酶活性：室温下在波长690nm处每隔1min测定1次反应混合液的od值，并绘制图表。结果表明重组人trx具有二硫键还原酶活性（图4）。
3 讨 论
硫氧还蛋白可通过调节某些转录因子表达对细胞起保护作用[7，8]。目前大量研究发现，trx参与了许多疾病的发病过程，如心肌等组织再灌注损伤的修复，帕金森病(pd)、阿尔茨海默病(ad)、多发性硬化等神经退行性病变的发生等。利用重组trx蛋白进行疾病的治疗，日益成为研究人员关注的焦点。
正确克隆出目的基因是研究的基础，高效表达相关蛋白是重组的关键步骤，高效表达重组蛋白需要选择合适的载体，带6个组氨酸的融合表达质粒应用于科学研究领域,为蛋白质科学的方法学研究提供了重要手段[9，10]。因为n 端或c 端带有6个连续组氨酸的蛋白质能与taldn金属螯合树脂结合,能通过一步层析就可以分离出高纯度的蛋白质。这6个组氨酸对金属螯合树脂具有巨大的亲和力，在非变性和变性条件下都能纯化出带6个组氨酸的融合蛋白，也可以用抗6个组氨酸抗体来检测这种融合蛋白的表达水平。这就为快捷地纯化和检测表达的蛋白质提供了可能。此外，由于带6个组氨酸融合蛋白易于固定到含金属鳌合树脂的固相物质表面,极大地方便了蛋白质相互作用的研究。pqe30、pqe31、pqe32即是带6个组氨酸的原核融合表达质粒, 由于组氨酸融合片段很短，抗原性很低，而且不影响蛋白本身的结构和功能，不需将其去除，就可以对蛋白的结构和功能进行研究，此结构还可以避免重组蛋白降解，所以本研究选用pqe32质粒作为表达载体进行表达研究。
我们用含saci和sali酶切位点的引物p3、p4扩增pgem
○r
-t easy/trx质粒。扩增产物中含有saci和sali酶切位点以及trx cdna的全长序列。然后用限制性酶切方法将trx的cdna片段克隆到pqe32质粒中，转入大肠杆菌，扩增、筛选阳性克隆。对阳性克隆进行酶切鉴定和克隆测序，确定重组质粒的正确性。重组质粒长度为3.8kb含有trx cdna的全长序列，trx cdna的上游有启动子和6个组氨酸的编码区。pqe-32/trx原核表达质粒构建成功为下一步进行重组蛋白的诱导和纯化奠定了基础。
重组蛋白在无诱导剂条件下通常不表达或表达量极低，为此我们将重组的pqe-32/trx质粒转入大肠杆菌m15中扩增，并采用0.5～1.0 mm的iptg进行诱导表达，筛选出iptg最佳诱导浓度为0.5mm，最佳诱导温度为37℃，最佳诱导时间为5h左右。人硫氧还蛋白含有105个氨基酸，分子量是12kd，由于pqe32表达载体n端带6-his标签，因此trx融合蛋白的分子量是14kd左右。诱导结果显示，14kd左右出现特异蛋白表达，随iptg诱导时间的延长表达量明显增加，诱导5h表达量最高。而空载体质粒诱导后无特异蛋白表达。为了进一步鉴定重组蛋白的特异性，我们采用人trx多克隆抗体进行western免疫印迹杂交。结果显示，iptg诱导后重组的pqe-32/trx质粒在14kd左右表达出现特异杂交条带，且随诱导时间的延长表达量明显增加。而空载体和重组质粒未诱导时均未出现阳性条带，说明重组的pqe-32/trx质粒只有在诱导条件下才表达trx蛋白。
我们对纯化的融合蛋白进行二硫键还原酶活力检测。dtt是trx的还原剂，在dtt存在时trx可以使胰岛素a，b链间的二硫键还原成游离的a，b两条链，而b链的溶解度差，可以使透明的反应液变混浊，并在690nm处有强烈的光吸收[11]。本研究采用此方法检测了trx的活性反应曲线，证实重组trx具有二硫键还原酶活性，可以应用于功能研究。本研究成功诱导表达出有活性的人trx，为进一步进行外源trx的保护作用研究提供了重要的实验基础。
【参考文献】
[1]yamawaki h, berk bc.thioredoxin: a multifunctional antioxidant enzyme in kidney, heart and vessels［j］. curr opin nephrol hypertens.2005,14(2):149-153.
［2］bai j, nakamura h, kwon yw,et al.does thioredoxin-1 prevent mitochondria and endoplasmic reticulummediated neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine?［j］.antioxid redox signal，2007 may,9(5):603-608.
［3］malik g, gorbounov n, das s,et al.ischemic preconditioning triggers nuclear translocation of thioredoxin and its interaction with ref-1 potentiating a survival signal through the pi-3-kinase-akt pathway［j］.antioxid redox signal，2006,8(11-12):2101-2109.
［4］akterin s, cowburn rf, miranda-vizuete a,et al.involvement of glutaredoxin-1 and thioredoxin-1 in beta-amyloid toxicity and alzheimer's disease［j］.cell death differ，2006，13(9):1454-465.
［5］ zhang h, tao l, jiao x,et al. nitrative thioredoxin inactivation as a cause of enhanced myocardial ischemia/reperfusion injury in the aging heart［j］.free radic biol med，2007,43(1):39-47.
［6］ glantzounis gk, yang w, koti rs,et al. the role of thiols in liver ischemiareperfusion injury［j］.curr pharm des，2006,12(23):2891-2901.
