【摘要】 【目的】考察大孔树脂ab8对黄柏总生物碱动态吸附和解吸的最佳工艺条件。【方法】采用ab8树脂对黄柏提取液中总生物碱进行动态吸附,以总生物碱的吸附量或解吸量为指标,分别考察了上样量、流速、杂质洗脱剂水的用量、洗脱剂的浓度和用量。【结果】动态吸附的较佳工艺条件为：每ml树脂上样50 ml样品,上柱流速20 ml(2个柱体积)/h,杂质洗脱剂水的用量为30 ml(3个柱体积),洗脱剂采用体积分数40%的乙醇,用量为60 ml(6个柱体积),在此工艺条件下操作,得到总生物碱的纯度为4006%,比上柱之前的纯度提高了256倍。【结论】该法简便易行，纯化效果好。
【关键词】 黄柏/化学;总生物碱/分析;大孔树脂;动态吸附;分光光度法，紫外线
黄柏为芸香科植物黄檗(关黄柏)phelledendron amurense rupr.或黄皮树(川黄柏) phelledendron chinense schneid.的干燥树皮。树皮中含有小檗碱(berberine)、木兰花碱(magnoflorine)、黄柏碱(phellodendrine)等多种生物碱及内酯、甾醇等,其中以小檗碱为主要药效成分[1]。目前对黄柏药材中总生物碱的提取分离纯化和含量测定研究较多,提取方法有超声—酶法提取[2]、醇提[3]、碱提[4],分离纯化方法有高速逆流色谱法[5]、离子交换法[6]、大孔树脂吸附[7]等,其中大孔树脂吸附技术用于黄柏提取液的分离纯化主要集中在静态吸附研究方面,动态吸附研究尚未见报道。wWW.11665.coM本实验对大孔树脂动态吸附黄柏总生物碱的工艺进行研究,旨在为工业化生产提供参考。现将结果报道如下。
1仪器与材料
uvmini1240紫外分光光度计(日本岛津)，ab8树脂(天津欧瑞生物科技有限公司)。黄柏(广东健泽药业有限公司,生产批号：081201,经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波老师鉴定为关黄柏phelledendron amurense rupr.的干燥树皮)。
2方法与结果
21总生物碱的含量测定方法
211标准曲线的制备
2111检测波长的确定分别吸取盐酸小檗碱标准品溶液和经适当稀释后的黄柏提取液,在200～600 nm之间进行波长扫描,两者在265 nm波长处呈现共有吸收峰,故确定检测波长为265 nm。见图1。
2112标准曲线的绘制精密称取干燥至恒质量的盐酸小檗碱对照品111 mg,置50 ml量瓶中,用01 mol/l hcl溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。准确量取盐酸小檗碱标准品溶液02、04、06、08、10、12,14、16 ml,分别置25 ml的量瓶中,加01 mol/l hcl定容至刻度,在265 nm处测吸光度,以吸光度为横坐标,浓度为纵坐标,作图,得直线方程为：y=0014 9x-0000 1，r=0999 9。结果表明盐酸小檗碱浓度在0001 8～0014 mg/ml之间,浓度与吸光度成良好的线性关系。
212黄柏总生物碱的提取方法取黄柏粉末200 g,加体积分数60%的乙醇加热回流提取3次,每次8倍量的溶剂提取1 h,合并3次提取液,过滤。滤液减压真空浓缩至无醇味。将提取液转移至1 000 ml的容量瓶,加蒸馏水定容至刻度,备用。
213黄柏提取液中总生物碱的含量测定取黄柏提取液02 ml,用01 mol/l hcl稀释至25 ml,在265 nm处测吸光度为0374,计算总生物碱的浓度为0684 mg/ml。
22动态吸附工艺研究
上样量和流速的确定：取预处理好的ab8树脂,湿法装柱(柱内径约11 mm,柱体积约10 ml)。加入黄柏提取液(上样浓度为0684 mg/l),控制流速20 ml/h,每30 ml(1个流份)收集1瓶,经适当稀释后测吸光度,计算其中总生物碱的浓度,结果见表1a和图2a。
同法操作,取黄柏提取液,控制流速分别为40、50 ml /h,每25 ml(1个流份)收集1瓶,经适当稀释后测每个流份中的总生物碱的浓度,结果见表1b,表1c,并绘制出泄漏曲线见图2b,图2c。表中吸附量和累积吸附量的计算公式如下：mi，吸附量=v(0684-ρi)，其中i为瓶号，v为流速(ml/h)，ρi为第i瓶的浓度(mg/ml);mn，累积吸附量=ni=1mi，吸附量。
从表1和图2可以看出,流速越小,树脂的饱和吸附量越大,20、40、50 ml /h的饱和吸附量分别为338610、321350、312530 mg。因为流速越小,树脂与样品的接触时间越长,传质越充分,吸附越完全。但流速过小,处理量低,产量下降,故选取流速为20 ml/h。同时,从表1a可以看出,到第18个流份时,即上样体积到540 ml时,流出液浓度高于上样液浓度的一半,也即样品经过树脂后,流出的总生物碱比吸附的还要多,树脂开始出现比较严重的泄漏,故选择上样体积为500 ml,即50 ml样品/ml树脂。表1a流速为20 ml/h的动态吸附穿透实验表1c流速为50 ml/h的动态吸附穿透实验
23洗脱工艺条件研究
231杂质洗脱剂水用量准确称取黄柏粉末500 g,加体积分数60%的乙醇加热回流提取3次,每次8倍量的溶剂提取1 h,合并3次提取液,滤过,滤液减压浓缩至无醇味,用水定容至25 l。取02 ml的样品溶液,加01 mol/l hcl定容至25 ml,在265 nm处测吸光度为0379,得总生物碱的浓度为0718 mg/ml。
取预处理好的ab8树脂,湿法装柱(柱内径约11 mm,柱体积约10 ml),以20 ml/h的流速加入500 ml的黄柏提取液,待上样液面与柱表面相平时,加入杂质洗脱剂水进行洗脱,每10 ml(1个流份)收集1瓶,经适当稀释后测其中总生物碱的浓度。同时将每瓶收集液干燥至恒质量,称其固形物的质量。表2结果显示：当洗脱用水至30 ml时,除去的杂质中总生物碱占很大的比例,故选择杂质洗脱剂水的用量为30 ml(3个柱体积)。
232洗脱剂的浓度和用量水洗之后依次用体积分数40%、60%、80%的乙醇各50 ml(相当于5个柱体积)洗脱,每10 ml(1个流份)收集1瓶,经适当稀释后测吸光度,计算每个流份中总生物碱的量。
将洗脱的实验结果绘制成曲线,见图3。
由表3和图3可以看出，50 ml(5个柱体积)的40%乙醇能将80%以上的总生物碱洗脱下来,40%、60%、80%的乙醇依次洗脱后,95%以上的总生物碱能被洗脱下来。据此,选择洗脱剂的种类为40%的乙醇,用量为60 ml(6个柱体积)。
24大孔树脂吸附试验准确称取黄柏粉末100 g,加体积分数60%的乙醇加热回流提取3次,每次8倍量的溶剂提取1 h,合并3次提取液,滤过,滤液减压浓缩至无醇味,用水定容至50 l。取02 ml的样品溶液,加01 mol/l hcl定容至25 ml,在265 nm处测吸光度,计算总生物碱的浓度。同时取10 l的黄柏提取液,干燥至恒质量,称固形物的质量,计算总生物碱的纯度。表2杂质洗脱剂水洗结果表3不同浓度的乙醇梯度洗脱结果
25 l的黄柏提取液,收集流出液,待上样液面与柱表面相平时,取流出液10 ml,定容至25 ml,在265 nm处测吸光度,计算流出液中总生物碱的量及吸附和残存在树脂内的总生物碱的量。加样完毕后,先加入150 ml(3个柱体积)的水洗脱,然后用300 ml(6个柱体积)的体积分数40%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱部分。取001 ml的洗脱液,用01 mol/l hcl定容至10 ml,在265 nm处测吸光度,计算解吸量。同时取50 ml的洗脱液,干燥至恒质量,称固形物的质量,计算总生物碱的纯度和转移率：p纯度=m总生物碱/m固形物;p转移=m总生物碱，洗脱液/46[其中46为100 g药材中总生物碱的质量(g)]。结果见表4。
3讨论
本研究采用ab8树脂对黄柏提取液中的总生物碱进行了动态吸附的的工艺考察,得到吸附的较佳条件：上样量为每ml树脂上样50 ml样品,上柱流速20 ml(2个柱体积)/h,杂质洗脱剂水的用量为30 ml(3个柱体积),洗脱剂采用体积分数40%的乙醇,用量为60 ml(6个柱体积),按照此工艺条件,得到总生物碱的纯度为4006%,比上柱之前的纯度提高了256倍。此方法简便可行,纯化效果好,能为有效部位研发及工业化生产提供参考。
在进行上样流速考察时本实验结果显示：(1)上样后,一开始就有泄漏,且因上样浓度很小,即使少量的泄漏在图中表现尤为明显。考虑到黄柏中的生物碱在水中的溶解度较小,所以没有对样品进行浓缩以增加上样浓度。(2)流速越大,泄漏越明显,可能是因为流速越大,传质越不充分。(3)泄漏曲线并不是一条很光滑的曲线。因为操作过程中流速很难控制恒定,并且收集的每个流份体积较小,流速的微小变化就会对每一瓶收集液的浓度产生很大的影响,所以导致曲线呈现波浪型。(4)流速小时,绘制出的泄漏曲线并不是标准的s型,而是呈逐渐上升的趋势,可能是因为流速小,吸附效果好,流出液的浓度变化比较平缓,而不会出现陡然的递增。为了得到较为美观的泄漏曲线,首先要保证上样液比较澄清,防止随着加样时间的延长,固体杂质堵塞固定床空隙,上样液流速逐渐减小,且最好采用蠕动泵加样,流速才能保持恒定。
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