作者：唐巧玉，周毅峰，任甜甜，江曼
【摘要】 目的研究大孔树脂分离水芹菜总黄酮的条件。方法利用静态吸附方法筛选分离水芹菜总黄酮的最适大孔树脂，利用动态吸附方法研究最适大孔树脂分离水芹菜总黄酮的条件。结果大孔树脂ab-8是吸附水芹菜总黄酮的效果最好，最佳分离条件是：上样速率是1.5 ml·min-1，5 bv80%的乙醇以1.0 ml·min-1的速率洗脱。结论利用大孔吸附树脂ab-8在以上最佳条件下，可使9.98%水芹菜总黄酮纯度提高到25.8%。
【关键词】 水芹菜； 黄酮； 大孔树脂
abstract：objectiveto study the condition of separating total flavonoids in bengal waterdropwort herb with macroporous resin.methodsusing static absorption, optimum macroporous resin which was used for separating total flavonoids in bengal waterdropwort herb was selected. using dynamic absorption, the condition of separating total flavonoids in bengal waterdropwort herb optimum macroporous resin was studied. resultsoptimum macroporous resin was ab-8, and the optimum codition was as follow:the speed that sample flows through macroporous resin was 1.5 ml·min-1, and the total flavonoids absorbed on macroporous resin can eluted by 80% ethanol of 5 bv, the elution speed was 1.0 ml·min-1.conclusionusing upwards condition, the purity of total flavonoids in bengal waterdropwort herb can be increased to 25.8% from 9.98%.
key words：oenanthe javanica； flavonoid； macroporous absorbent
水芹菜属伞形科多年生宿根草本水生植物，别名水芹。WWW.11665.COm水芹为伞形科水芹属植物水芹oenanthe javanica (oj)的全草，又名水英、野芹菜等［1］。其营养丰富，含有多种人体内不可缺少的营养物质，部分营养物质含量甚至超过旱芹，具有良好的食用价值［2］。同时，水芹在临床中对高血压病、高脂血症、心脑血管疾病、乙型肝炎患者具有防治作用［3，4］，其中水芹所含有的黄酮类物质发挥了重要作用。但目前的研究主要集中对水芹菜的栽培技术、育种、生产工艺、净化水体效果等方面，对于水芹黄酮的报道甚少［5，6］。本研究选水芹菜为材料基于水芹菜中黄酮类物质存在药理方面的作用，采用大孔吸附树脂法［7，8］对水芹菜黄酮类化合物进行分离纯化，筛选出一种较为合适分离纯化水芹菜黄酮的大孔吸附树脂，提高水芹菜提取物粗黄酮的纯度和生产效率，以期能得到具有高生物活性而无副作用的高纯水芹菜黄酮提取物。
1 材料与仪器
1.1 材料及处理水芹菜采于湖北民族学院后山。将新鲜水芹菜洗净，于60℃烘箱中烘干，粉碎，过孔径60目筛，装于棕色试剂瓶备用。
1.2 药品大孔吸附树脂nka、nka-9、x-5、ab-8(天津南开大学生产)；芦丁标准品(进口分装)，95%乙醇， 亚硝酸钠， 硝酸铝，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器al204电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，lxj-ⅱb离心机(上海安亭科学仪器厂制造)， re-201d旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)，可见光分光光度计(上海棱光技术有限公司)。
2 方法
2.1 树脂的预处理［9］将各种大孔吸附树脂，分别用95%的乙醇浸泡24 h，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分接触，以便从孔中赶出空气。将浸泡好的树脂上柱先用95%的乙醇冲洗,直至流出液无白色为止。然后用2 bv(2倍的上柱的大孔树脂的体积)的4%的naoh冲洗，并关闭30 min，用蒸馏水洗至中性。再用2 bv的5%hcl冲洗 ，并关闭30 min，最后用蒸馏水洗至中性，处理完毕后用蒸馏水浸泡保存。
2.2 水芹菜黄酮粗提液的制备称取一定量的样品，料液比1∶35，乙醇浓度80%，在90℃的水浴锅中回流提取2.5h，5 000 r/min离心15 min，取其上清液。将上清液在旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液5 000 r/min离心15 min，取其上清液，即得到黄酮粗提液。
2.3 水芹菜黄酮测定方法［10］水芹菜黄酮含量测定采用以芦丁为对照品的nano2-al(no3)3-naoh显色比色法。
2.4 大孔树脂静态吸附称取各种滤干湿大孔树脂1 g，放入相同型号的烧杯中,加入黄酮粗提液20 ml，放入电动振荡器上,振荡吸附24 h，过滤，吸取吸附后的溶液0.4 ml测其吸光度，计算出树脂在室温下的吸附量和吸附率。取吸附饱和的树脂，加入80%的乙醇20 ml，浸泡振摇4 h，过滤，取解吸后的溶液0.3 ml，测定滤液中黄酮的浓度，根据黄酮解吸量计算解吸率。
2.5 ab-8大孔树脂动态吸附上柱速率测定：取处理好的ab-8大孔吸附树脂8g，装柱约10 cm高。将6份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 bv的水洗柱，80%乙醇5 bv洗脱，然后测定其吸附率。
乙醇解吸浓度确定：将5份50 ml 0.3 mg ·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5ml·min-1的速率进行上柱，再用5 bv的水洗柱，分别用5 bv20%，40%，60%，80%，95%的乙醇进行洗脱，然后测其解吸率。
乙醇洗脱体积确定：将6份50 ml 0.3 mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 bv的水洗柱，分别用80%的乙醇2，4，5，6，7，8 bv进行洗脱，然后测其解吸率。
乙醇洗脱速率测定：将5份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 bv的水洗柱，分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇5 bv，然后测其解吸率。
3 结果
3.1 吸附量的确定大孔吸附树脂的性能对黄酮的纯化效果有一定的影响，是由其物理和化学结构所决定,树脂的孔径、比表面积及极性等是影响吸附性能的重要因素，树脂吸附的本质是吸附剂和吸附质之间的范德华力，几种树脂的型号和物理结构参数见表1。表1 4种大孔树脂的物理性质
以“2.4”项的方法对x-5，ab-8，nka-9，nka 4种大孔吸附树脂对水芹菜黄酮水溶液的吸附量做测定。从表2可看出，ab-8大孔吸附树脂对水芹菜黄酮水溶液的吸附量最大，x-5次之。说明对水芹菜总黄酮的树脂柱的吸附应优先选用弱极性的树脂。从表3可看出，ab-8大孔吸附树脂对水芹菜黄酮水溶液的解吸率最大，nka次之。综合考虑各树脂的吸附和解吸性能，选用ab-8大孔吸附树脂来分离纯化水芹菜黄酮粗提物。表2 4种大孔树脂吸附性能的比较，表3 4种大孔树脂解吸性能的比较（略）
3.2 上样速率的选择上样速率一般都要求较慢，这是因为流速过快，吸附效果差，吸附不完全。但是流速过慢，会延长生产周期，增加成本。因此有必要选择一个合适的上样速率使之既能达到一定的吸附率又能尽可能的节约时间。实验按“2.5”项的方法测定了上样速率对吸附效果的影响，（见表4）。吸附率随上样速率的增快而降低，黄酮吸附率和上样流速呈极显著线性负相关，线性回归方程为：y=-4.314 8x+83.809 3（y：吸附率%，x：上样流速ml·min-1）。但是在综合考虑吸附率和应用于生产中的周期长短，选取 1.5ml·min-1的上样流速。表4 上样流速对吸附效果的影响（略）
3.3 解吸液浓度的选择为了研究ab-8大孔吸附树脂解吸水芹菜黄酮的最佳乙醇洗脱浓度，实验通过测定ab-8大孔吸附树脂解吸前后黄酮含量来确定不同乙醇洗脱浓度的解吸率，结果见表5。当乙醇浓度小于80%时，乙醇浓度和解吸率呈极显著的线性相关，相关系数r=0.927 842(大于0.75)，线性方程y=0.823 3x+3.398 9（y：乙醇浓度%，x：解吸率%）。当乙醇解吸浓度大于80%时，其解吸效果呈现下降趋势，因此实验所采用的乙醇解吸的浓度梯度中，以乙醇解吸浓度为80%的解吸效果最佳。表5 乙醇浓度对解吸效果的影响（略）
3.4 乙醇洗脱体积的选择在确定了乙醇的最佳浓度之后，进一步对洗脱液的最佳用量进行了确定，其原则是在充分洗脱所吸附黄酮的前提下，尽量节省洗脱剂的用量。从表6可以看出，当乙醇的洗脱用量达到5 bv时，解吸率为73.22.%，超过5 bv时，解吸率基本不再增加。因此，本实验所采用的乙醇洗脱体积为5 bv。表6 洗脱体积对解吸效果的影响（略）
3.5 洗脱速率的选择为了研究ab-8大孔吸附树脂吸附水芹菜黄酮的最佳洗脱速率，实验通过“2.5”项的方法测定ab-8大孔吸附树脂洗脱前后黄酮含量来确定不同洗脱速率的解吸率，结果见表7。从表7可看出当洗脱速率大于1.0 ml·min-1时，解吸速率和吸附率呈极显著的线性负相关，r=-0.9903，线性方程：y=-7.6x+85.08(y：解吸速率ml·min-1，x：吸附率（%)。当洗脱速率小于1.0 ml·min-1时，解吸效果呈下降趋势，因此本实验所采用的乙醇洗脱速率梯度中，以洗脱速率1.0 ml·min-1解吸效果最佳。表7 洗脱速率对解吸效果的影响（略）
3.6 树脂的富集能力配制黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液50 ml，以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 bv的水洗柱，以1.0 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇50 ml。收集流出液、水洗液及解吸液，测得解吸液黄酮浓度为0.212 mg·ml-1。分别取20 ml上柱前黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液和上柱后的解吸液，在旋转蒸发仪中浓缩，烘干，冷却。测得纯化前黄酮纯度为9.98%，纯化后纯度为25.8%，黄酮回收率为70.53%。
4 讨论
本实验主要对4种不同型号的大孔吸附树脂nka、nka-9、x-5、ab-8对水芹菜黄酮粗提物的静态吸附和解吸性质进行了研究，发现ab-8大孔吸附树脂在几种常用的用于富集黄酮的大孔树脂中吸附与解吸能力最好，并通过动态吸附实验对上样速率、解吸液浓度、解吸液体积及洗脱速率进行了研究，确定该树脂的最佳条件为：以1.5 ml·min-1的流速上样后，然后用5bv80%的乙醇以1.0 ml·min-1的速率洗脱。经树脂富集后黄酮的纯度为25.8%，比纯化前的纯度提高了1.59倍。
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