作者：邱如意， 许军， 徐伟， 刘燕华
【摘要】 目的从选取的7种极性不同的大孔树脂中，确定分离纯化杏香兔耳风总黄酮的最佳树脂。方法以杏香兔耳风中总黄酮的静态吸附和动态吸附的各种参数为指标, 确定最佳的大孔吸附树脂。结果在实验条件下,综合各种指标，发现ab-8 型树脂对杏香兔耳风总黄酮的分离纯化的效果最好。结论大孔吸附树脂法能有效地分离纯化杏香兔耳风中的总黄酮，且ab-8型大孔树脂效果最好。
【关键词】 杏香兔耳风; 黄酮类化合物; 大孔吸附树脂
abstract:objectiveto select the best resin from 7 different polar macroporous resins, for separation and purification of ainsliaea fragrans champ of the total flavonoids. methodsusing the static and dynamic absorption parameters of total flavonoids from ainsliae of ragrans champ as the indicators, the best macroporous resin was determined.results ab-8 resin had best effect for separation and punfication of ainsliaea fragrans champ. conclusionmacroporous resin can effectively separate and punify the total flavonoids from ainsliaea fragrans champ, and type ab-8 macroporous resin is the most effective.
key words:ainsliaea fragrans champ; flavonoids; macroporous resin
杏香兔耳风又名白走马胎、金边兔耳草，为菊科植物铁灯兔耳风ainsliaea macroclinidioides hay或杏香兔耳风ainsliaea fragrans champ.的干燥全草[1]，主要分布于长江流域一带及西南各省。WWw.11665.coM具有清热补虚、凉血止血、利湿解毒等功效，民间全草入药，用于治疗肺结核咳血、感冒咳嗽、咽喉疼痛、跌打损伤、无名肿毒、泌尿疾病、慢性宫颈炎等。杏香兔耳风全草的主要有效成分为黄酮类、有机酸类等化合物[2]。
大孔吸附树脂起源于20世纪70年代，是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，利用它巨大的表面积进行物理吸附，在实际应用中对一些与其骨架结构相近的分子如芳香族环状化合物具有很强的吸附能力，广泛应用于制药及天然植物中活性成分如皂苷、黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物的提取分离[3]。
本实验通过d101型、ab- 8型、hpd-100型、hpd-400型、hpd-417型、hpd-450型、hpd-600型7种大孔吸附树脂，对杏香兔耳风中黄酮类化合物的静态和动态吸附性能进行了研究，以期寻找到对杏香兔耳风黄酮类化合物进行精制纯化的一种较合适的方法。
1 材料
树脂：d101型、ab- 8型、hpd-100型、hpd-400型、hpd-417型、hpd-450型、hpd-600型(沧州宝恩化工有限公司);sartorius bs110s电子天平;超声波清洗器 hn1003(广州华南超声设备厂);uv-2401分光光度计(日本岛津公司) ;qyc-200全温空气摇床 (上海福玛实验设备有限公司)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供, 批号1115382-200301)。
2 方法
2.1 药液的提取称取一定量杏香兔耳风干燥药材，用70%乙醇作为溶剂,水浴回流提取3～4次,合并提取液,减压浓缩至无醇味,加蒸馏水溶解,即得杏香兔耳风样品液。
2.2 总黄酮含量测定
2.2.1 芦丁标准曲线的制备精确称取芦丁对照品0.026 40 g,用70%乙醇溶解，定容至100 ml，摇匀，配成0.26 mg/ml的标准溶液，备用。
精密吸取对照品溶液0，1,2,3,4,5,6 ml，分别置于25 ml容量瓶中，分别加70%乙醇至10 ml，精密加入5%亚硝酸钠溶液 1 ml，混匀，静置 6 min。精密加入10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀后静置 6 min，精密加入4%氢氧化钠溶液 10 ml，再加70%乙醇至刻度 ，摇匀，放置 15 min。以第1管作空白在波长510 m 处用紫外-可见分光光度计测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为 10.56～63.36 μg/ml，a=10.799c+0.015 7，r2=0.997 7。
2.2.2 供试品总黄酮含量的测定取待测样品两份,减压浓缩至干,用甲醇溶解,按“标准曲线的制备”项下标准，测定样品的吸光度值，平行测3次, 取平均值, 然后用标准曲线方程计算样品中总黄酮的含量。
2.3 树脂的预处理[4]取上述市售新鲜的7种大孔树脂，分别用95%酒精浸泡数小时，用大量蒸馏水洗净。以湿法在搅拌下将树脂加入到层析柱中，等树脂沉降后再将水放出，用95%的乙醇3bv/h通过树脂层，至流出液加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水以同样的流速洗至中性，备用。所用树脂的型号及参数见表1。表1 吸附树脂的型号及物理参数
2.4 树脂的选择准确称取处理后的7种大孔树脂湿树脂各1 g于具塞磨口三角瓶中，加入杏香兔耳风样品液50 ml，25℃恒温振荡24 h，振荡频率140 r/min。过滤、保留滤液，用蒸馏水洗涤树脂，再将树脂浸泡在70%乙醇中，25℃恒温振荡24 h解吸，测定滤液即吸附上清液和解吸液中总黄酮的浓度。
2.5 静态吸附实验
2.5.1 吸附等温线的建立准确称取1 g ab-8湿树脂于具塞三角瓶中，加一定浓度的料液各50 ml,于18，25，32℃下静态吸附，每隔2 h取样0.5 ml，测定各个时段取样液中总黄酮浓度，绘制吸附等温线。
2.5.2 吸附动力学曲线的建立准确称取1 g ab-8湿树脂于具塞三角瓶中，加一定浓度的料液各50 ml,于25℃下静态吸附，每隔2 h取样0.5 ml，测定各个时段取样液中总黄酮浓度，绘制吸附等温线。
2.5.3 解吸条件优化[5]称取8g ab-8树脂于烧杯中，加入一定浓度的料液400 ml，静态吸附24 h,滤出树脂, 过滤后按质量平均分成8份, 分别置于8个锥形瓶中, 各加入10%, 30%,50%, 60%, 70%,80%,90%,100%的乙醇溶液, 静态解吸24 h。抽滤, 并用各自的洗脱剂冲洗树脂, 合并入滤液, 得到洗脱液, 测定各自的总黄酮含量, 并计算解吸量。
2.6 动态吸附实验
2.6.1 上样液浓度的考察称取ab-8型树脂50 g 4份,湿法装入4根2 cm×50 cm色谱柱中。选择4个浓度药液( 1.0,1.8,3,4.5 mg/ ml) ,加入量依次为450，250，150，100 ml ,以1.5 ml/min的上样速度、70%乙醇洗脱,洗脱液定容至450 ml，测定总黄酮含量后浓缩,烘干,并称重洗脱物。
2.6.2 上样液ph值选择称取ab-8型树脂50 g 4份,分别装入4根2 cm×50 cm色谱柱中, 分别加入4份1.8 mg/ml 的药液250 ml ,调ph值为4，5，6.2(原液)和8，分别以1.5 ml/min 的上样速度、70%乙醇洗脱,洗脱液定容至450 ml ,测定总黄酮含量后浓缩，烘干,称重洗脱物。选出上样液的ph值最佳为6.0。
3 结果
3.1 树脂对杏香兔耳风总黄酮的选择性本文研究了7种树脂对杏香兔耳风总黄酮的选择吸附性。计算公式如下：
吸附量=v(c0-c1)/m
吸附率=[(c0-c1)/c0]×100%
解吸量=c2×v/m
解吸率=[c2/(c0-c1)]×100%
式中c0为吸附前样液中黄酮浓度，c1为吸附后上清液中黄酮浓度，c2为解吸液中黄酮浓度，v为样液体积，m为湿树脂质量。结果见表2。表2 不同树脂对杏香兔耳风总黄酮的吸附和解吸能力从表2可以看出，ab-8大孔树脂对杏香兔耳风总黄酮的吸附和解吸能力都最大，所以筛选出ab-8作为本实验的研究。
3.2 吸附等温线根据静态吸附实验，24h树脂完全达到吸附平衡，根据下式计算出吸附量q。
q=v0(c0-c1)/m
式中，q为吸附量，mg/g为湿树脂;c0为初始黄酮溶液浓度mg/ml,c1为黄酮溶液的平衡浓度mg/ml，m为湿树脂的质量g。以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制吸附等温线见图1。
图1 ab-8对杏香兔耳风总黄酮的吸附等温线
从图1可以看出，树脂在25℃时的吸附效果最好，温度过高或过低树脂的平衡吸附量均下降。这可能是由于高温时杏香兔耳风总黄酮的溶解性增加，导致树脂对其的吸附能力下降;低温时的杏香兔耳风总黄酮水溶性降低，容易析出而不易被树脂吸附。
3.3 吸附动力学曲线吸附动力学特征反映的是随时间的延长，树脂对样品分子吸附量的变化趋势。经过i次取样后，总黄酮浓度c与吸附量q之间的关系可用下式表示：q=σ(ci-1-ci)(v0-0.5i)/m(i=1-n)
式中，q为吸附量,mg·g-1湿树脂;c为异黄酮浓度，mg·g-1;m为湿树脂的质量,g。以吸附时间h为横坐标，剩余浓度ci为纵坐标绘制动力学曲线，见图2。
图2 25℃时树脂对杏香兔耳风总黄酮吸附动力学曲线
从图2可以看出，ab-8树脂对总黄酮的吸附量在4 h内较大，吸附速度快，在4～6 h内吸附速度慢，在6 h后速度趋于平缓，在6 h时达到最大吸附。因此静态吸附6 h即可达到吸附饱和。
3.4 解吸条件优化一般地,对于非极性树脂,洗脱剂的极性越小,洗脱力越强。本实验选择了与环境友好的乙醇水溶液作为洗脱剂, 比较不同浓度的乙醇水溶液的洗脱效果,通过考察解吸量来确定洗脱溶剂。不同浓度的乙醇水溶液的洗脱效果见图3。
图3 不同醇度的洗脱剂对解吸量的影响
从图3可以看出，当醇度达到70%时，解吸量达到最大，因此可以选择70%的乙醇作为洗脱剂。
3.5 动态吸附结果
3.5.1 上样液浓度的考察结果见表3。表3 最佳上样液浓度考察结果从表3可以看出，上样液浓度为1.8 mg·g-1时，洗脱的总黄酮量最大，纯度最高，浓度过高或过低都对总黄酮的洗脱量有影响。
3.5.2 上样液ph值的确定(见表4)。如表4所示，上样液的ph值对化合物的吸附和分离有一定的影响。在吸附过程中，物质一般以分子状态被吸附剂吸附。结果显示，当上样液为原液即弱酸性时，洗脱的总黄酮含量和纯度都最大，可能杏香兔耳风的黄酮类物质大多呈弱酸性，在弱酸性状态下呈分子状态被吸附剂吸附，偏酸或偏碱会使物质呈游离状态，不利于吸附，可能在上样的时候泄漏下来。表4 最佳上样液ph值的考察结果
4 讨论
本实验用7种树脂进行筛选，结果显示ab-8树脂对杏香兔耳风总黄酮具有较好的选择吸附性和解吸能力，所以选用ab-8树脂进行本实验的工艺研究。
纯化杏香兔耳风中总黄酮的最佳工艺条件为：ab-8型大孔树脂，25℃下， 上样液浓度为1.8 mg·g-1，上样液ph值为6.2(即原液)，静态吸附6 h，用水冲洗水溶性杂质，再用70%乙醇洗脱，洗脱物总黄酮含量可达57%以上。
【参考文献】
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[m].上海：上海科学技术出版社，1999：6682.
[2] 邢春秀,谢 宁,杨念云，等.杏香兔耳风的化学成分[j].江苏药学与临床研究, 2006，14(2):107.
[3] 陈凯云,杨武亮,龚千峰，等.大孔吸附树脂富集大蓟中总黄酮类成分的工艺研究[j].时珍国医国药，2007，18(10):2362.
[4] 高荣海，李长彪，刘长江，等.大孔吸附树脂对大豆异黄酮吸附性能的研究[j].食品工业科技，2006，10：49.
[5] 薛淑萍,张立伟.大孔吸附树脂提取、分离桑叶总黄酮的条件优化[j].山西中医学院学报,2006,8(1):51.
