作者：容蓉，杨勇，陈明强，邱丽丽，孙秀梅，张丹
【摘要】
摘要：目的研究芎䓖汤不同提取部位对小鼠急性心肌缺血的保护作用。方法分别制备芎䓖汤乙醇提取液过大孔吸附树脂柱的20%，40%，60%，95%乙醇洗脱部位（ee20，ee40，ee60，ee95部位）。用腹腔注射异丙肾上腺素造成小鼠急性心肌缺血模型，观察不同洗脱部位对心电图、红细胞膜流动性的影响。 结果ee20，ee40，ee60部位对异丙肾上腺素引起的心肌损伤小鼠，可拮抗s-t段异常变化；ee20，ee40部位可显著性降低荧光探剂dph标记的小鼠红细胞膜荧光偏振度，增强红细胞膜流动性。 结论芎䓖汤ee20和ee40部位对实验性心肌缺血有明显的保护作用。
【关键词】 芎䓖汤 急性心肌缺血 心电图 红细胞膜流动性
abstract：objectiveto explore the protective effect on acute experimental ischemic myocardium in mice by different elutes from macroporous resin for separation of xiongqiong decoction. methodsthe ethanol extract from xiongqiong decoction was obtained firstly. then 20, 40, 60 and 95 percent ethanol elute (ee20, ee40, ee60 and ee95) were prepared by using the column stuffed with absorbent macroporous resin. acute myocardial ischemic model induced by intraperitoneal administration of isoproteronol (iso) in mice was adopted to observe the effects of the different elutes on the electrocardiogram and the membrane fluidity of erythrocytes. resultscompared with the model group, ee40 and ee60 could reduce the elevation of st segment induced by iso. ee20 and ee40 could decrease the fluorescence polarization which demonstrated the effect of increasing the cell membrane fluidity in the inactive state. conclusionthe extracts of ee20 and ee40 have protective effect against iso-induced acute myocardial ischemia in mice.
key words： xiongqiong decoction; acute myocardial ischemia; eelectrocardiogram; membrane fluidity of akaryocyte
中药复方芎䓖汤出自《千金方》，由当归angelica sinensis (oliv.) diels.和川芎ligusticum chuanxiong hort.等份组成，具有养荣活血的功效。wWW.11665.cOM现代药理研究证明，川芎、当归可以抗血栓形成，抑制血管平滑肌细胞增生，显著增加脑血液流动性，保护、减轻脑缺血造成的脑部病理损害，缓解由此引起的行为障碍［1～3］。本课题采用大孔吸附树脂柱对芎䓖汤乙醇提取物分离纯化，制备不同浓度乙醇洗脱部位，考察其对急性心肌缺血小鼠心电图及红细胞膜流动性的影响，评价芎䓖汤不同提取部位在活血方面的活性。
1 仪器与试药
1.1 动物昆明种小鼠，spf级，体质量18～22 g，雌雄各半，购于山东中医药大学实验动物中心，许可证号scxk（鲁）20070004。
1.2 仪器bl-420e+生物机能实验系统（成都泰盟），rf-540型荧光分光光度计（日本岛津公司）；re-52c型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.3 药材和试剂当归、川芎药材（购自济南市建联药店）；大孔吸附树脂hp20（日本三菱化学公司）；盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol, iso）注射液（上海禾丰制药有限公司，批号6e20003，规格0.5 mg·ml-1）；荧光探剂dph(1，6-二苯基-1，3，5-己三烯；sigma公司，批号109f3518)；pbs磷酸盐缓冲溶液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号zli-9062）；生理盐水（山东长富洁晶药业有限公司）；戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司，批号f20021216）；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号0512104）。
2 方法与结果
2.1 芎䓖汤大孔树脂柱洗脱物灌胃溶液的制备当归、川芎药材粉碎，过20目筛，分别取500g，混合，加12倍量70%的乙醇回流提取3次，1.5h/次，合并提取液，回收乙醇，浓缩至2 000 ml。以1∶3的比例（药材质量与树脂体积比）过hp20大孔树脂柱，分别用10倍量的水、20%，40%，60%和95%的乙醇洗脱，收集不同浓度的醇洗脱部位，减压回收乙醇，浓缩至每毫升溶液相当于1 g当归、川芎的生药量。分别取各醇洗脱部位提取液200 ml，水浴60℃浓缩至近干，加少许吐温80使成混悬液，转移至50ml量瓶中，加水定容至刻度（分别简称ee20，ee40，ee60和ee95）。
2.2 盐酸异丙肾上腺素剂量的选择取36只小鼠，随机分为4组，每组9只，分别为空白对照组及腹腔注射异丙肾上腺素4 ml·kg-1组，6 ml·kg-1组和8 ml·kg-1组。给小鼠称重，0.05%戊巴比妥钠（8 ml·kg-1）麻醉，用bl-420e+生物机能实验系统分别记录空白对照组和腹腔注射盐酸异丙肾上腺素不同剂量组的小鼠s-t段在30 s、1，5，10，20 min的偏移值，从预试结果来看，注射盐酸异丙肾上腺素6 ml·kg-1的剂量在5，10，20 min时间点有显著性差异，注射8 ml·kg-1的剂量虽然也有显著性差异，但容易导致小鼠死亡，故选择盐酸异丙肾上腺素的剂量为小鼠体重注射6 ml/kg，连续注射2 d，监测的时间点为5，10，20 min。
2.3 对异丙肾上腺素致小鼠急性心肌缺血心电图的影响
2.3.1 分组及给药实验前在麻醉下记录小鼠正常心电图1次，对心电图异常者予以剔除。用于实验的小鼠随机分为6组，每组10只，各组分别为空白组，模型对照组，ee20组，ee40组，ee60组，ee95组。空白组和模型对照组均给蒸馏水，剩余组均给予药30 ml·kg -1，连续给药9 d。
2.3.2 造模及指标检测空白组在给药的第8，9天腹腔注射生理盐水6 ml·kg-1，其余组分别在给药的第8，9天注射异丙肾上腺素6 ml·kg-1，在注射之前用0.05%的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，并记录肢体ecgⅱ导联心电图1次，末次注射异丙肾上腺素之后在麻醉状态下即刻记录5，10，20 min的肢体ecgⅱ导联心电图，测量s-t段的偏移值（即△s-t）。
数据采用spss 11.0版统计软件处理数据，多组间比较用方差分析和p-lsd(最小显著差)法检验。以p<0.05为有显著性差异，以p<0.01为有非常显著性差异。数据以±s表示，结果见表1。表1 不同洗脱部位对实验小鼠心电图s-t段数据变化（略）
由表1可见，空白对照组与模型对照组在不同时间点相比均有非常显著性差异（p<0.01）；与模型组相比，在5 min时ee20组有非常显著性差异（p<0.01）；在10 min时ee20组有非常显著性差异（p<0.01）、ee40组有显著性差异（p<0.05）；在20 min时ee20组、ee60组有显著性差异（p<0.05）。
2.4 对红细胞膜流动性的影响在“2.3”项实验完成后，小鼠摘眼球取血于0.1%的肝素抗凝的试管中，将抗凝血离心5 min（800 r·min-1）；取压积红细胞0.1 ml，加入2 ml生理盐水，混匀，2 500 r·min-1离心5 min；吸去上清液，再用2 ml生理盐水洗涤红细胞一次；吸去上清液，加入0.4 ml pbs液；取上述pbs液0.1 ml，用pbs稀释至6 ml，均分为3等份，其中两只管为标记管，一只管为空白管；在标记管中加入2 ml浓度为2×10-6 mol·l-1 dph标记液，空白管中加入2 ml pbs缓冲液，混匀；25℃恒温水浴中避光温育30 min，温育毕，离心（2 500 r·min-1）5 min后弃去上清液，再用4 ml pbs缓冲液洗涤两次，用4 ml pbs缓冲液将红细胞悬起。上机测定，激发波长（ex）364 nm,发射波长（em）457 nm，根据公式①计算荧光偏振度p［4］，激发光光轴呈垂直方向时测得的水平以及垂直方向的荧光强度为ivh和ivv。
p=iw-givhiw+givh①
式中，p为荧光偏振度；g为仪器校正因子，校正由于单色器所产生的附加偏振。
iw=iw1+iw22-iw空白 ivh=ivh1+ivh22-ivh空白
iw-起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度。
ivh-起偏器光轴在垂直方向上，检偏器光轴在水平方向上时的荧光强度。根据公式 η=2p0.46-p，p为所测的荧光偏振度，计算微黏度η。
数据采用spss 11.0版统计软件处理数据，多组间比较用方差分析和p-lsd(最小显著差)法检验。以p<0.05为有显著性差异，以p<0.01为有非常显著性差异。数据以±s表示。结果见表2。表2 不同提取部位对实验小鼠红细胞膜的荧光偏振度和微黏度影响（略）
由表2可知，模型对照组与空白对照组相比，荧光偏振度p有降低的趋势，即红细胞膜流动性或变形能力增强。与模型对照组相比，ee20组和ee40组的荧光偏振度p降低，微黏度降低，有非常显著性差异（p<0.01）。
3 讨论
心肌持续缺血将导致心肌组织损害, 并出现s-t段缺血性改变，腹腔注射iso诱发小鼠急性心肌缺血损伤模型是研究抗心肌缺血药物的经典模型。本课题采用该模型后发现，模型对照组小鼠ip iso后其ecgⅱ导联s-t段出现了明显的缺血表现。ee20组、ee40组和ee60组对此异常s-t段变化具有显著抑制作用；可拮抗iso引起的s-t段异常变化，可使小鼠异常变化的ds-t明显降低。说明芎䓖汤抗急性心肌缺血的作用,其机制可能涉及到冠脉扩张和冠脉流量的增加。ee20组在5，10，20 min时间段都有较强的抗心肌缺血作用，ee40组在10 min、ee60组在20 min有较强的抗心肌缺血作用，这可能与各洗脱部分活性物质组成不同，在体内的吸收及代谢速度不同有关。
本实验所用荧光探剂dph是疏水性的，用以标记膜脂双层的碳氢链区，测量这两种探针与膜结合的荧光偏振度并计算出微粘度，能定量地说明膜蛋白与膜脂分子的运动情况，从而了解膜的流动性。荧光偏振度可反映膜脂区的微黏度，p值越大，微黏度越大，膜流动性愈小；反之，值越小，微黏度越小，膜流动性愈大。实验结果显示，ee20组、ee40组可显著性降低dph标记的小鼠红细胞膜荧光偏振度，增强红细胞膜流动性。
红细胞是主要的气体交换单元，其变形性是改善血液状态、发挥红细胞携氧功能、保证微循环灌注、完成气体交换任务的必备条件。本实验表明，小鼠ip iso所造成的急性心肌缺血模型的心电图ds-t已有显著性改变，表明心肌细胞已经受损。而此时红细胞膜荧光偏振度p值较空白组却下降，提示红细胞膜流动性增强，亦即红细胞流动性增强。焦晓慧等［5］也发现大鼠心肌缺血时红细胞膜荧光偏振度p值下降，膜流动性也增强，故缺血时红细胞膜流动性增强可能也是代偿性反应。ee40组中抗血栓有效成分阿魏酸含量较高［6］，可能也促进模型小鼠的红细胞膜流动性代偿性增高，以改善其心肌缺血症状，具体机制还有待进一步研究。
对芎䓖汤不同部位抗急性心肌缺血实验发现，芎䓖汤醇提物经大孔吸附树脂分离的ee20、ee40和ee60部位可拮抗iso引起的ds-t升高，可使小鼠升高的ds-t明显降低，能够保护心肌细胞，起到抗急性心肌缺血的作用，增加细胞的抗缺血缺氧能力；通过红细胞膜流动性实验发现，ee20、ee40部位可增强红细胞膜的流动性，改善急性期缺血的能量代谢障碍的状态，防止心肌的进一步坏死。该研究对筛选芎䓖汤活血活性部位、进一步发现其活血活性成分具有重要的指导意义。
【参考文献】
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