【摘要】 目的 研究术前放化疗对直肠癌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, vegf）和微血管密度（microvessel density, mvd）表达的影响。方法 78例低位直肠癌患者，随机分为两组。术前放化疗组（治疗组）予放疗40 gy，同时给予folfox 4方案化疗两次，放疗结束后4～6周接受手术治疗，对照组入院后直接接受手术，手术标本在常规病理检查的同时作肿瘤组织vegf和mvd的表达分析，用半定量计分方法计算vegf表达，用weidner计分法进行mvd记数。结果 vegf积分治疗组为1.05±0.35,对照组为1.91±0.78, p＜0.01；mvd值治疗组为12.6±3.45，对照组为23.8±7.67，p＜0.01；治疗组肿瘤缩小，手术切除率和保肛率高于对照组。结论 术前放化疗可明显抑制肿瘤组织的vegf和mvd表达，并有术前降期作用。
【关键词】 直肠肿瘤;放射治疗;血管内皮生长因子;微血管密度
the influence of chemotherapy and radiotherapy before operation on the colorectal tumor angiogenesis and its clinical significance
wang yongbing, miao xudong, huang sheng, et al. pudong new area people’s hospital, shanghai 201200, china
[abstract] objective to research the influence of chemotherapy and radiotherapy before operation on the microvessel density (mvd) and vascular endothelial growth factor (vegf) gene expression of colorectal cancer. methods seventyeight patients who suffered from lower colorectal cancer were divided into 2 groups randomly. patients in the therapy group received radiotherapy for 40 grays as well as folfox4 chemotherapy for twice, then operation therapy 46 weeks after the end of radiotherapy. patients in the control group received operation directly after admission. all the specimen obtained from operation underwent the routine pathologic study as well as gene expression analysis of vegf and mvd in tumor tissues. a semiquantitative method was used to score the gene expression of vegf, and the weidner method was used to count the mvd. results scores of gene expression of vegf in the therapy group were 1.05 0.35, while it were 1.91 0.78 in the control group(p＜0.01). counts of mvd in the therapy group were 12.6±3.45, and 23.8±7.67 in the control group(p＜0.00). the rate of tumor shrinking, resection and anus sparing of the therapy group were all significantly higher than those of the control group. conclusion chemotherapy and radiotherapy before operation can repress the gene expression of vegf and mvd in tumor tissues, and had downstaging effect before operation.
[key words] colorectal tumor; radiation therapy; vascular endothelial growth factor (vegf); microvessel density (mvd)
局部浸润和复发是影响直肠癌手术切除和预后的关键因素，微血管生成在肿瘤的浸润和复发中起重要作用，如何抑制肿瘤微血管生成，提高直肠癌手术切除和减少复发是近年研究的热点[1]。WWW.11665.Com本研究对照分析术前放化疗对直肠肿瘤血管生长因子和微血管密度的改变，发现术前放化疗对其有积极的影响，现报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 2004年1月至2007年6月南通大学第二附属医院和上海市第八人民医院收治直肠癌患者78例，男45例，女35例，年龄42～75岁，平均(2.3±7.82)岁。肠镜病理确诊为直肠癌（距肛门3～7 cm），术前hildebrandt 和feifel法超声分期为t3、t4期，无糖尿病和严重高血压（可能影响微血管）。随机将本组病例分为两组：治疗组（术前放化疗组）37例，和对照组（直接手术组）41例。两组的年龄、病理、超声分期无统计学差异。
1.2 标本获得 治疗组病例入院后先予放疗，放疗设备为美国ge公司医用电子直线加速器，10mvx射线，采用前后对穿固定野照射。照射范围上界为腰5骶1，下界为闭孔下缘，两侧为髂外1 cm，前后两野对穿照射；剂量：2 gy/次，5次/周，连续4周，总计量为40 gy，同时folfox4方案化疗2次，放疗结束后4～6周手术。对照组入院后检查无手术禁忌证即行手术。两组手术方式视术中情况行doxin、miles、park、hatman或肠造瘘，获得的病理标本在常规石蜡切片的同时做vegf和mvd免疫组化测定。
1.3 实验方法及步骤
1.3.1 实验试剂 vegf单克隆抗体、 viii因子相关抗原(fviiiag)多克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶免疫组织染色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。
1.3.2 实验步骤 取以上病例术后根治标本，经10%福尔马林固定，在肿瘤深处和边缘切取标本进行常规石蜡包埋，5 μg 厚连续切片，分别进行he染色及免疫组化染色。切片经二甲苯脱腊后，酒精梯度水化，入0.3%h2o2 30 min阻断内源性过氧化物酶活性，然后入0.01 mmol/l、ph为6.5的94℃枸橼酸盐缓冲液15 min以暴露修复抗原，降至室温后，羊血清封闭10 min以封闭非特异性抗原，分别滴加鼠抗人ⅷ因子相关多克隆抗体（1∶100稀释），鼠抗人vegf单克隆抗体（1∶200稀释）后4℃冰箱过夜，次日洗去一抗后，再依次加入二抗、三抗工作液各37℃孵育1 h，洗去后经dab工作液显色10 min，苏木素复染30 s,脱水，透明，封片。实验严格按说明书操作，用pbs代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。
1.3.3 结果判定 vegf的判断使用半定量计分方法[2]，vegf表达阳性为胞质染成黄色颗粒，以细胞阳性百分率得分之和进行判定，随机选择5个高倍视野（×400）进行判断:无染色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分，并统计表达阳性率。微血管计数采用weidner[3]计分法：①fviiiag多克隆抗体阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色为标准。②切片在100倍光镜下挑选微血管分布密度最高区域，在200倍光镜下计数5个不重复视野中被cd34染成棕黄色的微血管数，取其平均值作为mvd，每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管，只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数，而直径大于8个红细胞的血管，有厚的平滑肌的血管和硬化区的血管不在计数范围内。
1.4 统计学处理 采用spss12.0专用统计软件包对数据进行统计学分析，率的比较采用χ2检验，评价vegf、mvd与临床资料的关系时采用独立样本t检验，相关性分析采用 spearman相关分析,统计结果以p＜0.05为差异有显著性。
1.5 结果
1.5.1 直肠癌组织形态变化 放化疗后直肠癌组织大体检查表现为癌灶表面较光滑干净，癌组织质地较硬，纤维化明显，与周围组织有一个比较明显的界线，光镜下可见癌组织大部分为纤维组织，可见坏死癌细胞，癌细胞数明显较对照组少，残存癌细胞散在或巢状，小片状分布在纤维组织中。治疗反应i级为坏死或癌细胞消失超过整个病灶的1/3，共5例；ii级反应为坏死或癌细胞消失超过整个病灶的2/3，但仍有存活的癌细胞，共29例；iii级反应为整个病灶全部坏死和/或被纤维组织取代，伴或不伴肉芽组织形成，没有存活的癌细胞，共3例。
1.5.2 直肠癌组织中微血管形态和密度变化 直肠癌组织中微血管染色呈棕红色，绝大部分为管腔样结构，治疗组和对照组癌组织中微血管形态明显不同，治疗组微血管管径大小较一致，管腔明显较对照组小，微血管数量较少，mvd值治疗组为12.6±3.45，对照组23.8±7.67，p＜0.01。见表1和图1。表1 手术后两组mvd比较比较
1.5.3 直肠癌细胞vegf表达的情况 vegf在细胞浆和细胞膜中表达，治疗组染色较淡呈棕黄色，表达阳性率为(27±7.3)%，对照组呈棕红色，表达阳性率为(57±18.7)%；分值治疗组1.05±0.35,对照组1.91±0.78, p＜0.01。见表2和图2。表2 术后两组vegf表达值比较（±s）
1.5.4 手术结果 治疗组根治性手术率为94.59%（35/37），对照组为78.04%(32/41)，p＜0.05；治疗组保肛门率为86.48%(32/37)，对照组为68.29%，p＜0.01。经1～3年随访，手术后1年治疗组局部复发率为5.43%(2/37),对照组为12.19%(5/41), p＜0.01。生存率两组无显著性差异(91.89% v.s.87.80%,p＞0.05)。
2 讨 论
2.1 vegf的临床意义 肿瘤血管的形成受多种血管生长因子所调节，vegf被认为是最重要的因子。vegf是一种相对分子质量为34～46 ku的二聚体糖蛋白，它有4种分子变异，分别含121、165、189和206个氨基酸，其中前两者易达靶细胞，并表达于多种组织中[3]。vegf可由各种肿瘤细胞和某些正常细胞产生，并可通过旁分泌方式与位于血管内皮细胞或某些肿瘤细胞表面的vegf受体（flt1和kdr/dflt1）特异性结合，直接刺激内皮细胞增殖，改变内皮细胞基因的活化方式，诱导内皮细胞表达蛋白网的水解酶，间质胶原酶和组织因子，在原位诱导血管的生成，并且有利于癌细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散，为肿瘤的浸润和转移创造条件，因此，vegf对肿瘤新生血管生成和间质产生具有重要意义，特别是实体瘤的关系密切。
2.2 mvd的临床意义 肿瘤细胞的快速增殖能力依赖于微血管网络的不断扩张，肿瘤血管来源有两种，一种为宿主血管肿瘤化，即来自正常组织延伸的微血管或残存肿瘤内的宿主血管逐渐变为肿瘤血管；另一种为肿瘤新生血管，即由肿瘤本身产生细胞生长因子诱导瘤体生成血管。伴随着血管发生，癌灶生长迅速，肿瘤新生血管缺乏或仅有基底膜片段，新生血管为肿瘤细胞脱落进入血循环提供了开放门户，肿瘤血管密度越大癌细胞脱落进入血循环的概率越大，血管生成与直肠癌浸润、转移密切相关，许多研究表明血管生成的定量指标mvd能反映直肠癌血管尤其是新生血管的生成情况，可作为肿瘤发生、转移及预后的独立指标[4,5]。
2.3 放化疗对mvd及vegf的影响 术前放化疗是直肠癌主要辅助治疗手段之一，放射线可直接作用于肿瘤细胞及周围新生血管内皮细胞的dna分子链，导致dna链的断裂，并可增加组织细胞的自由基产生，诱导肿瘤细胞和新生血管内皮细胞凋亡，抑制肿瘤细胞和新生血管内皮细胞的增殖，使肿瘤的mvd密度明显下降，从而导致肿瘤细胞缺血坏死。另一方面，由于放疗使肿瘤细胞凋亡，肿瘤细胞产生的vegf明显减少，使肿瘤组织的vegf表达明显下降，反过来使肿瘤的微血管形成速度大大下降，减少肿瘤细胞的血供，延缓肿瘤生长，加速肿瘤凋亡。化疗本身有相同作用，并有放射增敏作用，两者同时使用，产生叠加作用，并可抑制全身转移。本课题中放疗组mvd值显著低于对照组（p＜0.01），且微血管形态也有明显差异，治疗组微血管管径趋向一致，管腔明显较对照组小。血管内皮细胞增殖能力较强，因而对放射线敏感性较强，容易被放射线杀灭，术前放疗使癌组织内微血管减少，降低癌组织血供，这对减少术中癌细胞播散也具有重要意义。本研究发现放射治疗后癌组织中vegf表达的程度和百分比均较直接手术组明显下降(p＜0.01)。因此，我们认为放射治疗后癌组织中微血管的变化一方面与放射线直接造成血管内皮细胞损伤有关，另一方面与vegf表达明显下降、使肿瘤微血管内皮细胞失去vegf刺激有关。从手术方式和术后初步随访结果，可以明显看到，术前放化疗组的保肛率达86.48%，明显高于对照组的68.29%（p＜0.05）。初步的随访结果显示，术前放化疗组的疗效优于对照组。
【参考文献】
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