【摘要】 目的 探索p16基因甲基化状态与结直肠癌(crc)早期诊断的可行性。方法 从61例crc患者、21例腺瘤患者和20例正常对照者粪便中提取dna,采用巢式甲基化特异性pcr(nmsp)技术分析其p16基因甲基化改变状态。结果 crc、腺瘤、正常对照者粪便标本p16基因甲基化检出率分别为77.0%(47/61)、59.3%(16/27)、5.0%(1/20)。检测p16基因甲基化诊断crc的敏感性和特异性分别为71.6%和95.0%。p16基因甲基化的阳性状态与crc患者年龄、性别、肿瘤发生部位无明显关系，p16基因甲基化的阳性状态与肿瘤的dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移有关。结论 p16基因甲基化改变发生在crc形成的早期阶段，检测粪便dna中p16基因的甲基化状态有望成为crc早期无创诊断及crc高风险人群筛查诊断的新途径。
【关键词】 crc;粪便;p16基因;甲基化
the significance of p16 methylation analysis is in stool in early diagnosis of colorectal cancer
ling zhian，chen lisheng，he chungang，et al.department of surgery,first affiliated hospital of guangxi medical university,nanning 530021,china
[abstract] objective to evaluate the possibility of p16 gene methylation change in stool for screening early colorectal cancer.methods th dna was isolated from fecal samples from 61 patients with colorectal cancer,21 patients with adenoma and 20 normal volunteer,the methylation status of p16 gene was analyzed with nest methylationspecific polymerase chain reaction (nmsp).results methylated.p16.gene.occurred.in.77.0%(47/61),59.3%(16/27),5.0%(1/20) of patients with colorectal cancer,adenomas and nomal.the sensitivity and specificity of p16 gene methylation assay for colorectal cancer was 71.6% and 95.0%,the p16 gene methylationpositive rate of the colorectal cancer had no significant relationship.with the age,sex and tumor site of the colorectal cancer patients.but the p16 gene methylationpositive rate of the colorectal cancer had significant relationship.with the dukes staging of the tumor,the degree of differentiation and lymph node metastasis.conclusion the p16 gene methylation occurred in the early stages of colorectal cancer.analysis of fecal p16 gene methylation is expected to serve as a new early detection way for colorectal cancer or a new screening tool for individuals at highrisk of developing colorectal cancer.
[key words] colorectal cancer;stool;p16 gene;methylation
结直肠癌(crc)是一种基因病，是最常见的恶性肿瘤之一，对人类健康构成重大威胁。WWW.11665.Com在欧洲结直肠癌发病率及死亡率排在恶性肿瘤的第二位[1]，近年来，随着我国生活条件和饮食习惯的改变，结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，发病率在恶性肿瘤中排第五[2]。近期研究表明,dna甲基化异常与人类肿瘤关系密切,常常是肿瘤发生发展过程中的早期事件[3]，因此,特异基因的甲基化可作为肿瘤早期诊断的分子标记物。抑癌基因存在甲基化状态的改变,导致一些抑癌基因转录功能丧失,使抑癌基因失活而发生癌变。p16基因一种抑癌基因，由于其在多种肿瘤中的高频率突变及甲基化改变而引起了许多学者的广泛兴趣。p16抑制基因的失活能引起细胞无限制分裂增殖，最终导致肿瘤发生。crc组织的细胞持续脱落到粪便中,因此,检测粪便中crc相关抑癌基因的甲基化状态有可能成为crc早期无创诊断的一条新途径。我们运用巢式甲基化特异性pcr(nmsp)检测crc患者粪便中p16基因的甲基化改变情况，以证实p16基因甲基化是否发生在crc形成的早期阶段，并且在crc形成后是否仍继续保持及p16基因的阳性状态是否与患者性别、年龄、肿瘤的发生部位、dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移相关，旨在为以后crc的早期无创诊断探索一条新的筛查途径。
1 资料和方法
1.1 一般资料 收集2007年3月至2007年12月我院61例crc患者标本，男37例，女24例，中位年龄为58岁，每例标本均由病理证实。27例腺瘤患者中，男16例，女11例，年龄25～78岁。并同期选择相匹配的20例正常对照者(10例痔病患者、3例肛瘘患者、2例便秘患者和5例正常自愿者)，其中男12例，女8例，年龄22～75岁。所有患者入院或门诊检查时均检测粪便潜血和血清癌胚抗原。粪便标本于手术前和内镜检查前收集，收集后半小时内送实验室，分装后置于-80℃超低温冰箱冻存备用。
1.2 方法
1.2.1 粪便dna提取及亚硫酸氢盐修饰 取(200±20)mg粪便，采用dna提取试剂盒“qiaamp dna mini kit”提取dna，方法按照试剂盒说明进行。之后在紫外分光光度计上测od值(od值均在1.7～1.9之间)，计算出dna的浓度及总量(dna量在15～100 μg之间)。利用亚硫酸氢盐对dna进行化学修饰使甲基化及非甲基化的dna序列产生不同转变。双链dna变性解链后，在亚硫酸氢盐作用下，未发生甲基化的胞嘧啶(c)转变为尿嘧啶(u)，而甲基化的c则不发生变化的原理进行dna的亚硫酸氢盐修饰[4]。
1.2.2 巢式甲基化特异性pcr 利用巢式甲基化特异性pcr[5]原理检测p16基因的甲基化状态。巢式甲基化特异性pcr引物为：上游 5′gaagaaagaggaggggttgg3′下游 5′ctacaaaccctctacccaacc3′。npcr反应体系为20 μl：dna模板 3 μl，10×longtaqbuffer 2 μl，longtaqdna聚合酶 0.2 μl，dntp 1 μl，上下游引物各0.4 μl，灭菌用水 13 μl。pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 60 sec，以上步骤共35个循环，72℃延伸7 min。
1.2.3 甲基化特异性pcr 以巢式甲基化特异性pcr反应产物1∶1000稀释为模板,进行msp扩增。甲基化特异性pcr的引物：p16基因甲基化的引物：p16mf：5′ttattagagggtggggcggatcgc3′,p16mr：5′gaccccgaaccgcgaccgtaa3′;p16基因非甲基化的引物：p16uf：5′ttattagagggtggggtggattgt3′;p16u
r：5′caaccccaaaccacaaccataa3′。甲基化特异性pcr反应体系为25 μl：dna模板1 μl，10×longtaqbuffer 2.5 μl，longtaqdna聚合酶 0.25 μl，dntp 1 μl，上下游引物各0.5 μl，灭菌用水 19.25 μl。p16m pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 40 sec，67℃ 30 sec，72℃ 30 sec，以上步骤共35个循环，72℃延伸7 min。p16u pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 40 sec，63℃ 30 sec，72℃ 30 sec，以上步骤共35个循环，72℃延伸7 min。经上述两次pcr扩增后，将8 μl pcr产物加到含eb的2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统观察结果并拍照。
1.3 统计学处理 本试验数据采用spss13.0统计软件处理，计数资料采用χ2检验，p<0.05为差异有显著意义。
2 结 果
2.1 甲基化检测 108例粪便dna均顺利提取dna，其含量为15～100 μg之间，所有粪便dna均成功实现亚硫酸氢盐修饰、巢式甲基化特异性pcr和甲基化特异性pcr。p16基因甲基化检测结果见图1.2.3。61例crc粪便标本中有47例检测到p16基因甲基化(77.0%);腺瘤患者p16基因甲基化检出率为59.3%(16/27);正常对照者粪便标本p16基因甲基化检出率分别为5.0%(1/20)。根据p16基因甲基化检出率与“金标准”检测法的比较得粪便p16基因甲基化检测诊断crc和腺瘤的敏感性为71.6%，特异性为95.0%，正确诊断指数(66.6%)，准确度为76.0%。
2.2 甲基化与粪便潜血试验和癌胚抗原检测结果比较 同一组61例crc肿瘤患者粪便中的潜血试验和空腹抽外周血查癌胚抗原的检出率分别为40.9%和49.2%，均明显低于粪便标本p16基因甲基化检出率77.0%(p<0.01)。
2.3 crc患者年龄、性别、肿瘤部位与p16启动子甲基化改变的关系比较 在61例crc粪便标本中，有47例(77.0%)标本检测出p16基因启动子区甲基化。p16基因甲基化与患者性别、年龄和肿瘤发生部位没有明显的相关性(见表1)。 表1 crc患者粪便中p16基因甲基化与患者年龄、性别、肿瘤部位的关系
2.4 crc患者dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移与p16甲基化改变的关系比较 p16基因甲基化在dukes分期a、b和c、d期中检出率分别为63.6%和92.8%，差异显著(p<0.05);其次，低分化肿瘤组织中p16基因启动子甲基化检出率为100%，中、高分化肿瘤组织中p16基因启动子甲基化检出率为70.2%，二者差异非常显著(p<0.05);同时，有淋巴结转移的患者肿瘤组织中p16基因甲基化的检出率(90.6%)高于无淋巴结转移(62.1%)的患者，并呈显著性差异(p<0.05)(见表2)。 表2 crc肿瘤粪便中p16基因甲基化与肿瘤dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移的关系
3 讨 论
crc患者的生存率直接与诊断时疾病的严重程度相关,进展期crc患者术后5年生存率约为37%左右,而早期诊断的患者5年生存率则可达92%;并且早期发现和切除癌前病变的腺瘤,更有助于降低crc的发病率和死亡率。
p16基因是crc发生过程中起重要作用的常见突变基因。最近一些学者研究发现[6～10]均提示crc中p16基因高甲基化可能发生在癌变早期并与crc的恶性进展有相关性，揭示p16基因可能成为早期诊断crc的分子标志物。而粪便dna检测是目前除大便潜血试验以外唯一非侵入性crc筛查方法。预示粪便dna中p16基因可能成为早期诊断crc的分子标志物并成为crc无侵入性早期诊断的一种筛查途径。belshwa等[12]首先证实可检测粪便dna甲基化水平。muller等[12]的研究结果显示粪便sfrp2基因甲基化分析crc的检出率为77%～90%，lenhard等[13]报道粪便肿瘤高甲基化基因1(hic1)基因甲基化分析诊断crc的敏感性和特异性分别为42%和98%。这些研究表明，粪便dna甲基化检测有望成为crc筛查的新途径，具有良好的应用前景。
本实验利用msp方法对crc患者的粪便脱落细胞中p16基因甲基化的检测表明，crc患者p16基因的甲基化检出率较高，表明crc中p16基因甲基化是其失活的方式之一。p16基因的甲基化与肿瘤的部位、患者的年龄和性别没有关系，而与dukes分期、组织学分化程度以及是否有淋巴结转移存在密切关系。其中，dukesc、d期患者肿瘤组织中p16甲基化检出率明显高于dukesa、b期患者;低分化癌中的p16甲基化检出率高于高、中分化癌的检出率;淋巴结转移患者肿瘤组织中p16基因甲基化的检出率高于淋巴结未转移的病例。这提示p16基因的甲基化可能参与了肿瘤的发展过程，p16基因的甲基化可以作为估计crc诊断和预后的指标之一。本实验结果还显示:如果把粪便脱落细胞dna中p16基因msp阳性作为诊断crc的标准，则它的正确诊断指数和准确度比较高，也就是说，当粪便脱落细胞dna中p16基因的msp阳性时，要高度怀疑为恶性。但是，此判断标准漏诊率高(28.4%)。也就是说，当粪便脱落细胞dna中p16基因的msp阴性时，绝不能简单地认为为良性病变，仍然需要作其它检查来减低漏诊率以排除恶性可能，这为以后进一步研究提供理论依据。
综上，粪便p16基因的高甲基化的状态，与crc的发生发展密切相关。p16基因的甲基化高状态是crc进入晚期、淋巴结转移和预后差的表现之一。因此p16基因甲基化的检测可以作为判断crc自然病程和预后的参考指标，粪便脱落细胞dna中p16基因的甲基化分析可能作为crc诊断的一项可行的辅助检查，有望作为crc的无侵入性早期诊断的筛选指标。
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