【摘要】 目的: 研究sarscov n蛋白与map19之间的相互作用。方法: 利用免疫共沉淀试验验证sarscov n蛋白与map19的相互作用, 并利用western blot检测sarscov n蛋白对map19表达量的影响。结果: sarscov n蛋白与map19能够在细胞内相互作用, 且sarscov n能够显著提高map19的表达量。结论: sarscov n蛋白与map19能够在细胞内形成复合物, 将为进一步研究sarscov n蛋白与map19相互作用的生物学功能提供实验基础。
【关键词】 sarscov n; map19; 相互作用
study on interaction between sarscov n and map19
liu junli1, 2, cao cheng1, ma qingjun1
1institute of biotechnology, academy of military medical sciences, beijing 100850, 2pla 306 hospital, beijing 100101, china
[abstract] aim: severe acute respiratory syndrome coronavirus (sarscov) is the etiological agent of sars, an emerging disease characterized by atypical pneumonia. using a yeast twohybrid screen with the nucleocapsid (n)protein of sarscov as a bait, the n protein was found to interact with map19, a nonenzymatic protein of masp(mannanassociated serine protease). the interaction between sarscov n and map19 would be further tested in cells in this article. methods: the interaction between sarscov n and map19 was demonstrated by immuno coprecipitation, and the amount of map19 influenced by sarscov n was investgated by western blot. results: the interaction between sarscov n and map19 was already demonstrated by immunocoprecipitation. sarscov n greatly increased the amount of map19. conclusion: sarscov n can bind with map19 in cells. our study may be conductive to further research into the molecular mechanism of action between sarscov n and map19.
[keywords]sarscov n; map19; interaction
sars冠状病毒(sarscov)是sars感染的元凶, 以全长sarscov n蛋白为诱饵蛋白筛选人胎肝细胞cdna文库时, 发现sarscov n蛋白可能与map19相互作用。WWw.11665.comsarscov n蛋白是sars冠状病毒蛋白(sarscov)的结构蛋白, 与病毒rna 结合形成核衣壳, 是主要的抗原分子[1, 2]。map19是masps家族的成员, 是masp2的单一基因的选择性剪切产物[3]。 masps可通过mbl结合细菌或病毒表面的甘露糖残基结合而激活, masp2可水解补体c4和c2, 形成c3转化酶, 是凝集素活化途径激活补体的重要的酶[4]。凝集素活化途径是补体系统活化的第三条途径, 也是机体早期抵抗病原微生物感染的一种防御机制。mbl途径缺乏在成人和儿童中可诱发各种感染性疾病。所以, 一些病原微生物利用mbl来入侵细胞[5, 6]。
本研究利用免疫共沉淀(ip)实验验证sarscov n蛋白与map19的相互作用, 结果发现sarscov n蛋白与map19能够在细胞内相互作用, 且sarscov n能够显著提高map19的表达量, 该结果为sarscov n在sars致病机制的进一步研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 细胞培养 293细胞均用含100 ml/l胎牛血清和100 u/ml青霉素、 100 u/ml链霉素的dmem(invitrogen公司产品)在co2含量为50 ml/l的37℃孵箱中培养, 采用消化法进行细胞传代。
1.2 质粒构建 n基因 (genbank accession number ay274119) 从患者血清的sarscov rna 通过rtpcr获得, (带ecor i的上游引物, 5′cggaattccatgtctgataatggaccc3′; 带bamh i的下游引物5′gcggatccttatgcctgagttgaatc3′)。扩增产物用pcr纯化试剂盒(promega)进行纯化, 随后用ecor i和bamh i酶切, 然后与经过同样酶切的pegfpc1载体 (clontech)连接, 转化, 测序。随后, n基因被克隆到pcdna 3flag载体 (invitrogen), 构建了pcdna 3flagn表达质粒。
map19基因片段缺失了5′端22～56 bp的dna序列, 我们采取的策略是利用pcr反应补全缺失的片段。
补全map19基因片段所用引物: pf1(49 bp～89 bp) (带bamh i的上游引物)5′cgggatccatgaggctgctgaccctcctgggccttc3′; pf2(35 bp～99 bp)5′ccctcctgggccttctgtgtggctcggtggccacccccttgggcccgaagtggccg
gaacctgtg3′; pr(带ecor i的下游引物): 5′cggaattcctagaggctctgctctg3′。
1.3 细胞培养与转染 细胞转染采用vigoras lipofect(invitrogen, inc.)转染试剂, 严格按照转染试剂说明书进行操作。以φ100 mm的培养皿为例, 当培养皿中的细胞生长至覆盖60%～80%皿底面积时进行转染。转染前1 h将旧的培养基吸出, 加入4 ml含100 ml/l胎牛血清的dmem完全培养基。然后配制质粒dna脂质体混合物: 将10 μg质粒dna(单一质粒或两种以上共转染质粒)与4 μl脂质体分别用200 μl的150 mmol/l的nacl稀释。室温放置5 min后, 将两者混合, 轻微吹打混匀后室温放置15 min, 使dna与脂质体形成复合物。取出待转染细胞, 向培养皿中加入400 μl的质粒dna脂质体混合物, 轻轻摇动培养皿, 使dna脂质体复合物均匀分布在培养皿中。在孵箱中培养6～8 h后, 将含有脂质体的培养基吸出, 加入10 ml 含血清和抗生素的完全培养基继续培养。换液36 h后收集细胞。
1.4 免疫共沉淀 细胞转染36～48 h后收集细胞。φ100 mm的每皿细胞需加入600 μl单去污剂裂解液(50 mmol/l tris.cl、 150 mmol/l nacl、 10 g/l np40以及蛋白酶抑制剂(roche, inc)1片/25 ml)。小心吸取细胞裂解上清, 加入10～15 μl抗flag抗体(sigma)交联的琼脂糖珠, 在4℃旋转孵育2 h, 进行免疫沉淀反应。2 h后, ip产物用250 μl裂解液洗涤3次, 向ip产物中加入40 μl 1×sds凝胶上样缓冲液, 100℃水浴5 min。取离心上清及5 μl蛋白质预染marker(invitrogen, inc)进行sdspage凝胶电泳, 半干转移法转膜后, 分别用flag抗体(sigma)和sarscov n抗体(本室保存)进行western blot检测; 最后用ecl化学发光试剂(pekin elmer)进行化学发光反应。
1.5 sarscov n蛋白和map19的表达量分析 将gfp标签融合的sarscov n质粒(gfpn)和flag标签融合的map19质粒(flagmap19)在293细胞里共表达, 同时, 用gfp空质粒与flagmap19共转染293t细胞(作为对照)。36 h后裂解细胞, 细胞裂解物用抗flag抗体进行免疫沉淀反应, 免疫沉淀物经sdspage凝胶电泳后转膜, 并用抗flag抗体进行免疫印迹检测。在实验过程中, 为了保证每份样品的蛋白浓度一致, 采用biorad protein assay法对每份样品的裂解上清进行总蛋白定量, 并用抗βactin抗体进行检测以检查细胞内组成蛋白actin的量是否一致。
2 结果
2.1 拼接map19全长基因 由于从文库中筛选得到的map19基因片段缺失了a map19的n端编码第127氨基酸dna序列, 我们采取的策略是利用pcr方法直接合成缺失的n端片段(图1), 连接到载体, 测序表明正确。
2.2 sarscov n蛋白与map19具有相互作用 为了证实在哺乳动物细胞中两种蛋白可形成复合物, 我们采用带flag标签的质粒map19(flagmap19)和带gfp标签的sarscov n蛋白(gfpn)质粒共转染293细胞。在dmem培养基中培养36 h后裂解, 通过15 000 g离心制备细胞裂解物。细胞裂解物用抗flag抗体进行免疫沉淀反应, 免疫沉淀物经sdspage凝胶电泳后转膜, 并用抗sarscov n蛋白抗体进行免疫印迹检测(图2)。结果发现, 抗flag 抗体的ip产物中能够检测到gfpn的存在, 而作为阴性对照的鼠igg免疫沉淀物中则检测不到gfpn的存在。说明flag map19可特异性地与gfpn共沉淀, 形成复合物; 同时, 用flag空载体与gfpn质粒共转染293细胞时, 抗flag免疫沉淀产物中也检测不到gfpn, 从而进一步证实了免疫共沉淀反应的特异性。
2.3 sarscov n蛋白显著提高map19的表达水平 进一步地, 我们研究了sarscov n蛋白是否影响map19的表达水平, 我们将gfp标签融合的sarscov n质粒(gfpn)和flag标签融合的map19质粒(flagmap19)在293细胞里共表达, 同时, 用gfp空质粒与flagmap19共转染293t细胞(作为对照)。36 h后裂解细胞, 细胞裂解物用抗flag抗体进行免疫沉淀反应, 免疫沉淀物经sdspage凝胶电泳后转膜, 并用抗flag抗体进行免疫印迹检测。在实验过程中, 为了保证每份样品的蛋白浓度一致, 采用biorad protein assay法对每份样品的裂解上清进行总蛋白定量, 并用抗βactin抗体进行检测以检查细胞内组成蛋白actin的量是否一致。同时, 我们用抗gfp抗体检测ip产物以及细胞裂解物中gfpn的存在, 用鼠igg(作为阴性对照)进行免疫沉淀反应, 用抗flag 抗体进行检测, 结果检测不到flagmap19。结果, 从抗flag 抗体的ip产物以及细胞裂解物中, 可明显看到gfpn质粒和flagmap19质粒共转染293t细胞时, 在细胞内组成蛋白actin的量相同的情况下, map19分子的表达量明显地高于对照组的表达量(图3)。
3 讨论
以全长sarscov n蛋白为诱饵蛋白筛选人胎肝细胞cdna文库时, 发现sarscov n蛋白可能与map19相互作用。利用ip实验验证sarscov n蛋白与map19的相互作用, 结果发现sarscov n蛋白与map19能够在细胞内相互作用, 且sarscov n蛋白能够显著提高map19的表达量。据文献报道, sars在第2周出现的病情恶化可能不是由无控制的病毒复制造成的, 而更是由免疫病理损害造成的, 可能与机体免疫防御功能过度激活有关。最近的研究发现, sars患者的肺损伤除了病毒造成的损伤以外, 机体本身的免疫系统反应过于强烈、 免疫细胞释放的细胞或炎性因子过多造成的免疫病理也是一个主要原因[7]。我们推测, map19是masps家族的重要组成部分, masps能够参与补体的激活, 因此sarscov n蛋白与map19相互作用, 并显著提高map19的表达水平, 可能从而导致masps的过度激活, 过量的masp2水解补体c4和c2, 形成c3转化酶, c3转化酶的过量积累从而造成了机体免疫防御功能的过度激活。
【参考文献】
[1] 贺福初. sars严重急性呼吸系统综合症[m]. 北京.科学出版社, 2003: 36.
[2] update who. outbreak of severe acute respiratory syndrome worldwide[j]. mmwr morb mortal wkly, 2003, 52(12): 241-246.
[3] schwaeble w, dahl mr, thiel s, et al. the mannanbinding lectinassociated serine proteases(masps)and map19: four components of the lectin pathway activation complex encoded by two genes[j]. immunobiology, 2002, 205(4-5): 455-666.
[4] stover cm, sthiel m, thelen nj, et al. two constituents of the initiation complex o f the mannanbinding lectin activation pathway of complement are encoded by a single structural gene[j]. immunol, 1999, 162: 3481.
[5] hajela k, kojima m, ambrus g, et al. the biological functions of mblassociated serine proteases (masps)[j]. immunobiology, 2002, 205(4-5): 467-475.
