prp105132对体外小胶质细胞活化及il6产生的影响
【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6
【摘要】 目的 探讨prp105132作用下体外小胶质细胞的活化及对il6产生的影响。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量prp105132(0、20、40、80 μmol/l)干预小胶质细胞，elisa法检测24 h后细胞上清液中il6含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp105132剂量的增加，il6分泌量增多(p<0.01)。结论 prp能够诱导体外小胶质细胞分泌il6，并且具有剂量依赖关系。
【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6
【abstract】 objective to investigate the microglia secret il6 in the condition of prp105132. methods rat microglia culture was exposed to prp105132(0, 20, 40, 80 μmol/l) in vitro. the il6 level in cell supernatant was measured by commercial enzyme immunoassay (elisa) after 24 h. results microglia were activated in the condition of prp peptide. a dosedependent increase in il6 secretion by the prp105132 exposed rat microglia was obtained. conclusions prp may induce microglia secret il6.
【key words】 prion; microglia; interleukin6
朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(tses)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病，主要病理特征为脑组织中存在淀粉样改变，其主要成分为异常prp沉积，周围可见大量的胶质细胞〔1〕。WWw.11665.COM胶质细胞在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，并具有不同的免疫活性，构成中枢神经系统(cns)抵御病原体入侵的第一防线。细胞因子是固有免疫反应和适应性免疫反应的关键调节剂。在cns感染性疾病中，组织浸润性免疫细胞、cns相关的巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞已经被确定为cns特异性炎症中细胞因子的来源。然而，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的前炎症细胞因子和免疫调节性细胞因子的主要来源〔2〕。通过研究克雅氏病患者脑脊液，发现前炎症细胞因子白介素(il)6在脑脊液中含量升高〔3〕。本实验应用prp干预体外小胶质细胞，旨在进一步明确朊蛋白病中il6的可能来源。
1 材料与方法
1.1 朊蛋白肽段处理
prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)采用固相合成法合成，实验前将本条多肽取少量放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水稀释，并用稀乙酸将其调回中性ph值。
1.2 细胞培养
1.2.1 神经胶质细胞混合培养
取10只新生wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖dhanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖dhanks液洗脑组织块1～2次。剪刀剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的dmem/f12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。
1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代
第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用dhanks液3∶1稀释胰酶edta溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%edta，1∶1)，37℃下作用40 min。轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来。将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。
1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色
待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定40 min;0.01 mol/l磷酸缓冲液(ph7.3)清洗3次，每次5 min，4℃冰箱备用。sp法免疫细胞化学染色。
1.4 prp105132处理体外小胶质细胞
1.4.1 体外小胶质细胞分泌il6含量的测定
体外培养小胶质细胞24、48及72 h，收集细胞上清液，-20℃保存。il6含量检测采用abc夹心elisa法。
1.4.2 不同剂量prp105132对体外小胶质细胞分泌il6含量的影响
应用prp105132，分别为0、20、40、80 μmol/l剂量下干预小胶质细胞，采用abc夹心elisa法检测培养后24 h细胞上清液内il6含量。
1.5 统计学分析
计量数据采用x±s表示，用spss13.0统计软件分析。
2 结 果
2.1 培养小胶质细胞的活体观察
第一代小胶质细胞少，呈漂浮状，圆形，折光性强。传代培养5～10 d后，细胞贴壁，数量增多，并长成片，细胞出现较多短小弯曲的突起。加入prp105132肽段后小胶质细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状。
2.2 培养小胶质细胞纯度的鉴定
cd68单克隆抗体的免疫细胞化学染色显示，成片的细胞cd68免疫反应强阳性(即小胶质细胞)，细胞圆形，部分细胞有较短的突起。用苏木素复染的盖片，在镜下随机抽取5个视野，记数视野下的cd68阳性细胞和cd68阴性细胞(苏木素显示细胞核)，求出cd68阳性细胞的百分比。抽查5张盖片，其小胶质细胞阳性率均>95%。
2.3 il6的含量
体外培养小胶质细胞24、48、72 h上清液il6含量分别为(69.06±6.25)、(68.09±3.04)、(69.61±1.05) pg/ml，组间比较无显著性差异(p>0.05)。分别应用0、20、40、80 μmol/l剂量prp105132干预小胶质细胞，24 h后il6含量依次为(69.06±6.25)、(70.33±0.67)、(87.38±4.16)、(109.64±7.40) pg/ml，表明il6含量随prp105132剂量增大而增大，80 μmol/l组与其他三组组间比较有显著性差异(p<0.01)。
3 讨 论
prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)对应prpc的跨膜区域，是prpc向prpsc构型转变的关键部位〔4〕，是所有异常prp同工型的共有结构。在不同的环境(离子强度、ph值、溶质成分等)中表现不同的二级结构。prp105132在体外与整个prpsc有某些相同的性质，可形成淀粉样纤维，并具有蛋白酶k抵抗性。在实验中发现，体外培养小胶质细胞中加入该肽段后细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp剂量增加， il6分泌量增多，prp剂量80 μmol/l时il6的分泌量最高，进一步明确了prp105 132肽段对小胶质细胞的激活作用。
小胶质细胞激活是朊蛋白病的神经病理性损害特征，并且这种特征在体内和体外实验中均得到证实〔5〕。组织学研究发现朊蛋白病中，在cns小胶质细胞与异常朊蛋白的聚集有关,并发现体外朊蛋白诱导小胶质细胞介导炎症反应，导致神经元缺失〔6〕。小胶质细胞介导炎症反应需要各种细胞因子的合成和参与。目前已有研究证实prp可使小胶质细胞诱导表达cox2〔7〕，合成il1β、pge2〔8〕。本实验发现prp干预体外小胶质细胞后，培养上清液内il6含量升高，证实了朊蛋白病中小胶质细胞是细胞因子il6来源之一。
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